Name: incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور فيكتوريا بوتش وباوتشر جوشوا لإجراء مناقشات مفيدة وإسداء المشورة بشأن تحسين حبة القياسية تنتشر في ظروف المقايسة ومقايسة تبرعم تلطيخ البروتوكول. S.H.A. تدعمها جزئيا بمنحه من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة تحت جائزة 5T32 GM007092.

اليوم الأول:
1-عابر تعداء الخلايا غشائي
<ol><li>إذا رغبت في ذلك، من تعداء عابرة للبشرية الحبل الوريد غشائي الخلايا (هوفيك) استخدام النوكليوتيد الجينات التنظيمية (مثل مايكرو-الكشف أو الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)) والكاشف ليبوفيكتاميني المناسبة وفقا لأ?...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders.">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li><li>Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurorestorative+therapies+for+stroke:+underlying+mechanisms+and+translation+to+the+clinic.">Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic.</a> Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis.">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).</li><li>Sims, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericyte--a+review.">The pericyte--a review.</a> Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Tattersall, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+endothelial+interaction+with+macrophages+and+pericytes+demonstrates+Notch+signaling+function+in+the+vascular+microenvironment.">In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment.</a> Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+angiogenesis+and+its+assays.">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li><li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis.">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li></ol>

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لوصف مراحل معقدة والتفاعلات الخلوية الغيروية تنتشر الأوعية عن طريق تمكين الباحث توظيف النهج الوراثية والتصوير إجراء تحقيقات شاملة آليا. عند القيام التحليل، من الضروري أن كفاءة طلاء غشائي من الخرز تجري خلال حبة الخطوات الانفعالات. سوف يتم طلاء بطانية الفقراء و?...

الأوعية حيوية embryogenesis المناسبة والتئام الجروح، وكما أنها تلعب أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض بما في ذلك التقدم1 والشريان التاجي مرض السرطان. 2 , 3 وجود فهم أفضل لكيفية حدوث عملية تولد الأوعية خلال التطور الطبيعي، وكيف يتم إعادة تنشيطها في سياقات باثولوجي، أمر بالغ الأهمية لتطوير الرواية، والعلاجات الفعالة. نماذج المؤمنين في المختبر أن الخص المراحل الهامة وأنواع الخلايا المعنية في الأوعية في فيفو ضرورية للسماح للباحثين أفضل وصف الآليات الجزيئية التي يقود الأوعية وجعل الاكتشافات رواية في لائحة بطانية.
ناكاتسو وهيوز الأمثل مقايسة حبة تبرعم التي قد أظهروا يخضع للعديد من مراحل معروفة تنتشر الأوعية. 4 , 5 غرض الطريقة المعروضة هنا البناء على التحليل الأمثل ناكاتسو وهيوز من خلال دمج بيريكتييس في التحليل، حتى يمكن إدراج أدوار باراكريني وجوكستراكريني من الخلايا الجدارية في الخلية البطانية تنتشر في دراسات الرواية تولد الأوعية. بيريسيتيس هي الخلايا الجدارية التي تتحدد بدورها كالخلايا التي تحافظ على إغلاق الاتصال المادي مع خلايا غشائي بسبب المضمنة في غشاء الطابق السفلي والأوعية الدموية. 6 بيريسيتيس وخلايا بطانية مزاولة المعقدة عبر الحديث عن طريق إشارات المسارات بما في ذلك الشق الإشارات، إنج-Tie2، PDGFRβ، TGFRβ، وغيرها الكثير. 7 , 8 الماوس نماذج ناقصة في هذه المسارات مما يشير إلى إثبات التغطية بيريسيتي الفقيرة النامية المفرج في امبريوجينيسيس، مما أدى إلى إعادة عرض الأوعية الدموية الفقيرة والمفرج المختلة وظيفيا. 7 بالإضافة إلى ذلك، دور بيريسيتيس في الأوعية باثولوجي مهم ولكن في كثير من الأحيان تحت تقدير. على سبيل المثال، ميزة فريدة من نوعها للورم المفرج أن السفن التي غير ناضجة أكثر، راشح، ومختلة بسبب التغطية بيريسيتي الفقيرة. 9 أنه قد اقترح أن وجود أو عدم وجود بيريسيتيس هائلة تؤثر النمط الظاهري لورم الأوعية الدموية وهو وسيط هام للردود على الأوعية والعلاجات انتيتومور. 9 وهكذا، بما في ذلك دور بيريسيتيس في فحوصات في المختبر مفتاح لالتقاط أكثر تماما الآليات الهامة لتنظيم بطانية.
على الرغم من أن هناك العديد من الاختبارات في المختبر و السابقين فيفو المستخدمة حاليا لدراسة الأوعية، هناك أوجه قصور للنظر في كل منها. بعضها، مثل انتشار بطانية وفحوصات الهجرة بطانية، يتم تبسيط مفرط والتركيز على دالة بطانية واحدة في بيئة معزولة في زراعة الأنسجة من البلاستيك. 10 فحوصات أخرى تحدث في إعداد 3 الأبعاد (3D) أكثر، مثل المقايسة تشكيل أنبوب ماتريجيل،10 ولكن هذه الاختبارات لا يزال المفرطة والتركيز أكثر على قدرة خلايا بطانية ترحيل ونموذج حيثياته الأوعية الدموية الهياكل، خلافا لتنتشر من المفرج الموجودة من قبل. وعلاوة على ذلك، أي من هذه الاختبارات تتضمن أنواع الخلايا الجدارية. هناك السابقين فيفو نماذج مثل المقايسة الشريان الاورطي الحلبة التي تدمج بيريسيتيس الموجودة في الجهاز المضيف، ولكن التلاعب بالجينات لهذه النماذج تحديا أكبر بكثير نظراً لضرورة توليد نماذج الماوس الضربة القاضية أو المحورة وراثيا مسارات للفائدة. حبة نبتت المقايسة مثاليا نظراً لأنها نماذج تنتشر بطانية والانتشار والهجرة وحتى تشكيل ملامسة والتجويف في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. 4 المقايسة إخلاص تسمح بتقييم آليا إلى العديد من المراحل المختلفة لتنتشر، في حين لا يزال يسمح لمباشرة التعديل الوراثي لخلايا بطانية أو بيريسيتيس في أجواء أكثر الخاضعة للرقابة. الجلطات فيبرينوجين يحتوي على الخرز تبرعم يمكن بسهولة الثابتة، الملون، وتصويرها في مراحل مختلفة من نبتت؛ يمكن أيضا أن توضع هذه براعم في غرفة تصوير الحي القيام بالتصوير في الوقت الحقيقي لتنتشر. المنهجية المقدمة هنا مثالية لدراسة الآليات الأساسية لتولد الأوعية عن طريق في عمق فينوتيبينج وتحليل دقيق للمسارات تفعيلها خلال الأوعية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>HUVEC Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11095114</td>
			<td>10T1/2 Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td>NHLF Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-grade PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>For lifting HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15050065</td>
			<td>For lifting 10T 1/2 and NHLF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customs siRNAs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10T 1/2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHLF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex 3 microcarrier beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>t9549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>a3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator and hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well glass bottom plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G1.513F</td>
			<td>Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtration Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay

الأوعية نمو الأوعية الجديدة من المفرج الموجودة من قبل وهو عنصرا هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك امبريوجينيسيس والتنمية والتئام الجروح، ونمو الورم وورم خبيث، وأمراض العين والقلب والأوعية الدموية. نماذج فعالة في المختبر أن الخص بيولوجيا تولد الأوعية ضرورية لدراسة هذه العملية على نحو ملائم وتحديد آليات التنظيم التي يمكن أن تكون مستهدفة في نهاية المطاف لاستراتيجيات علاجية جديدة. والرزن الأوعية حبة قد ثبت سابقا أن الخص مراحل متعددة تنتشر غشائي في المختبر. ومع ذلك، حد من هذا التحليل الافتقار إلى من بطانية – تعمل الخلية الجدارية التفاعلات، التي مفتاح لتنظيم خلايا غشائي الجزيئية والمظهرية في فيفو. البروتوكول هنا يقدم منهجية لدمج الخلايا الجدارية في مقايسة الأوعية حبة ويوضح ارتباط ضيق غشائي الخلايا وبيريسيتيس أثناء تبرعم في المختبر. تفاصيل البروتوكول أيضا منهجية لإسكات فعالة من الجينات المستهدفة باستخدام siRNA في خلايا بطانية للدراسات الميكانيكية. وإجمالا، يوفر هذا البروتوكول في المختبر تحليل أن من الأنسب نماذج أنواع الخلايا المختلفة المشاركة في تنتشر الأوعية، ويوفر منبرا أكثر فسيولوجيا ذات صلة لتقييم العلاج واكتشاف رواية آليات التنظيم تولد الأوعية.

يسمح هذا البروتوكول لضيق ارتباط الخلية اثنان أنواع في المختبر، ووجود بيريسيتيس يكمل حدوث تبرعم (الشكل 1 أ، ب). كما يتيح البروتوكول الفعال إسكات (مثلاً عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي) الجينات من الفائدة في خلية نوع من الاهتمام مثل (في?...

Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

يعرض البروتوكول هذا الاعتداء حبة رواية في المختبر أن أكثر نماذج مناسب عملية في فيفو تنتشر الأوعية بإدراج بيريسيتيس. ويتيح هذا التعديل المقايسة حبة الخص أكثر إخلاص الغيروية التفاعلات الخلوية بين خلايا بطانية والخلايا الجدارية التي حاسمة بالنسبة للأوعية.

دمج بيريسيتيس حبة غشائي خلية نبتت الإنزيم

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

تقييم البطانية هجرة الخلايا بعد التعرض للمواد الكيميائية السامة

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

عزل من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من عضلات الماوس الهيكل العظمي

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

والرزن موائع جزيئية "تقييم التصاق الكريات البيض" إلى "خلايا بطانية" المستمدة من "الخلايا الجذعية Pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان" (هيبسك-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر وخط أنابيب حسابي لتحديد الإمكانات الأوعية الدموية لالذرية البطانية المشتقة من iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...