Name: incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Vi takker Dr. Victoria Bautch og Joshua Boucher for nyttig diskusjoner og råd om optimalisering standard perle spirende analysen betingelser og en spirende analysen flekker protokollen. S.H.A. ble delvis støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences under prisen 5T32 GM007092.

Dag 1:
1. forbigående Transfection av endotelceller
<ol><li>Eventuelt utføre en forbigående transfection av menneskelig Umbilical blodåre Endothelial celler (HUVEC) bruker gen-regulatoriske oligonucleotides (f.eks mikro-RNAs eller lite forstyrrende RNA (siRNA)) og den aktuelle lipofectamine reagensen i henhold til produsentens instruksjoner. Merk: Denne protokollen har hatt stor suksess utfører omvendt transfections med egendefinerte siRNA sekvenser og en ko...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders.">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li><li>Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurorestorative+therapies+for+stroke:+underlying+mechanisms+and+translation+to+the+clinic.">Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic.</a> Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis.">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).</li><li>Sims, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericyte--a+review.">The pericyte--a review.</a> Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Tattersall, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+endothelial+interaction+with+macrophages+and+pericytes+demonstrates+Notch+signaling+function+in+the+vascular+microenvironment.">In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment.</a> Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+angiogenesis+and+its+assays.">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li><li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis.">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li></ol>

Denne protokollen gir en metode for å karakterisere komplekset og heterotypic mobilnettet interaksjoner av spirende angiogenese ved å aktivere forskeren å ansette genetiske og tenkelig tilnærminger til foreta grundig mekanistisk undersøkelser. Når du utfører analysen, er det viktig at effektiv endothelial belegg av perler finner sted under perlen agitasjon trinnene. Dårlig endothelial belegg vil bli gjort tydelig, hvis perler ikke synes å ha en golf ball som grov overflate neste morgen før gel implantasjon og i...

Angiogenese er avgjørende for riktig embryogenesis og sårheling, og det også spiller nøkkelroller i mange sykdommer, inkludert kreft progresjon1 og coronary arterien sykdom. 2 , 3 har en bedre forståelse av hvordan angiogenese oppstår under normal utvikling, og hvordan den aktiveres i patologisk sammenhenger, er avgjørende for utviklingen av romanen, effektiv therapeutics. Trofaste i vitro modeller som recapitulate viktige faser og celletyper involvert i angiogenese i vivo er nødvendig for å tillate forskere å karakterisere molekylære mekanismer kjøring angiogenese og gjøre nye funn i endothelial regulering.
Nakatsu og Hughes har optimalisert en spirende perle analysen som de har vist gjennomgår de mange kjente stadiene av spirende angiogenese. 4 , 5 formålet med metoden som presenteres her er å bygge på analysen optimalisert ved Nakatsu og Hughes ved å innlemme perictyes i analysen, slik at freske celler i endothelial celle spirende paracrine og juxtracrine roller kan innlemmes i romanen angiogenese studier. Pericytes er veggmaleri celler som er definert av deres rolle som celler som har nær fysisk kontakt med endotelceller på grunn av deres bygges i vaskulær kjelleren membranen. 6 Pericytes og endotelceller delta i komplekse cross-talk via signalnettverk trasé inkludert hakk signalnettverk, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ og mange andre. 7 , 8 musen modeller mangelfull i disse signalveier viser dårlig pericyte dekning av utvikle blodkar i embryogenesis, fører til dårlig vaskulær remodeling og dysfunksjonelle blodkar. 7 i tillegg rollen pericytes i patologisk angiogenese er viktig men ofte under-verdsatt. For eksempel er en unik funksjon i svulst blodkar at fartøyene er umodne, lekk og dysfunksjonelle på grunn av dårlig pericyte dekning. 9 det har blitt foreslått at tilstedeværelse eller fravær av pericytes dramatisk påvirker fenotypen av svulst blodårer og er en viktig formidler av Svar å antiangiogenic og antitumor terapier. 9 derfor inkludert rollen pericytes i vitro analyser er nøkkelen til mer fullstendig fange viktig mekanismer for endothelial regulering.
Selv om det er mange i vitro og ex vivo analyser for tiden ansatt å studere angiogenese, finnes det mangler å vurdere i hver. Noen som endothelial spredning og endothelial migrasjon analyser, er altfor forenklet og fokusere på en endothelial funksjon i et isolert miljø på vev kultur plast. 10 andre analyser skje i en mer 3 dimensjonale (3D), som Matrigel rør formasjon analysen,10 men disse analyser er fortsatt unyansert og fokusere mer på evnen til endotelceller å overføre og danner de novo vaskulære strukturer, i motsetning til spirende fra eksisterende blodkar. Videre innlemme ingen av disse analyser veggmaleri celletyper. Det er ex vivo modeller som ring aorta analysen som innlemme pericytes i vert orgelet, men genetisk manipulering av disse modellene er mye mer utfordrende på grunn av nødvendigheten av knockout eller transgene musen modeller av den veier rundt. Perlen spirende analysen er ideelt fordi det modeller endothelial spirende, spredning, migrasjon og selv anastomose og lumen formasjon i en 3D matrise. 4 analysen trofast gir mekanistisk vurdering av de mange ulike stadiene av spirende, samtidig gir direkte genmodifisering av enten endotelceller eller pericytes i en mer kontrollert setting. Det fibrin clots som inneholder spirende perlene kan lett fast, beiset og fotografert på ulike stadier av spirende; disse spirer kan også plasseres i en live bildebehandling kammer å utføre sanntid avbilding av spirende. Metodene som presenteres her er ideelt for å studere grunnleggende mekanismer av angiogenese gjennom i dybden phenotyping og grundig analyse av veier aktivert under angiogenese.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>HUVEC Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11095114</td>
			<td>10T1/2 Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td>NHLF Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-grade PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>For lifting HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15050065</td>
			<td>For lifting 10T 1/2 and NHLF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customs siRNAs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10T 1/2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHLF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex 3 microcarrier beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>t9549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>a3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator and hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well glass bottom plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G1.513F</td>
			<td>Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtration Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay

Angiogenese er veksten av nye fra eksisterende blodkar og er en viktig komponent i mange biologiske prosesser, herunder embryogenesis og utvikling, sårheling, tumor vekst og metastasering, og okulær og hjerte sykdommer. Effektiv i vitro modeller som recapitulate biologi angiogenese er nødvendig å riktig studere denne prosessen og identifisere mekanismer regulere som kan målrettes til slutt for romanen strategier. Perle angiogenese analysen har vist tidligere for å recapitulate flere stadier av endothelial spirende i vitro. En begrensning av denne analysen er imidlertid mangel av endothelial-veggmaleri celle interaksjoner, som er nøkkelen til molekylære og fenotypiske regulering av endothelial celle funksjon i vivo. Protokollen gitt her presenterer en metode for inkorporering av veggmaleri celler perle angiogenese analysen og demonstrerer en stram sammenslutning av endotelceller og pericytes under spirende i vitro. Protokollen også detaljer en metodikk for effektiv stanse målet gener bruke siRNA i endotelceller for mekanistisk studier. Til sammen gir denne protokollen i vitro analysen som mer hensiktsmessig modeller de ulike celletyper i spirende angiogenese, og gir en mer fysiologisk relevante plattform for terapeutisk vurdering og romanen oppdagelsen av mekanismer av angiogenese regulering.

Denne protokollen gir en tett sammenslutning av de to cellen typer i vitro, og tilstedeværelsen av pericytes utfyller forekomsten av spirende (figur 1A, B). Protokollen kan også effektiv stanse (f.eks via RNA-interferens) av en genet av interesse i en celle type interesse for eksempel (VEGFA spesielt i endotelceller) eller PDGFRβ i pericytes7,12 under analysen, so...

Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Denne protokollen presenterer en roman i vitro perle analysen som mer hensiktsmessig modeller prosessen med i vivo spirende angiogenese ved å inkludere pericytes. Denne endringen kan perle analysen til mer trofast recapitulate heterotypic mobilnettet samspillet mellom endotelceller og veggmaleri celler som er avgjørende for angiogenese.

Bygge inn Pericytes i en Endothelial celle perle spirende analysen

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Vurdering av endotelcelle Migration etter eksponering for giftige kjemikalier

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammarfettpute-transplantasjonsteknikk for å visualisere fartøygenerering av vaskulære endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolering av type I og type II pericytter fra muskelsmuskler

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analyse av embryonale stamcelleforskningen blodkreft forløpere bruke enkeltcelle indeks sortering kombinert med endotelial celle nisje co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Prøvende celle mekanikk med perle-fri optisk pinsett i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic analysen for vurdering av leukocytter vedheft til menneskelig indusert Pluripotent Stamcelle-avledet endotelceller (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

En in vitro 3D modell og beregningsorientert rørledning å kvantifisere det Vasculogenic potensialet av iPSC-avledet endothelial forfedre

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...