Name: incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Agradecemos os Drs Victoria Bautch e Joshua Boucher discussões úteis e conselhos sobre como otimizar padrão do grânulo brotando condições de ensaio e um ensaio de germinação do protocolo de coloração. S.H.A. foi apoiada em parte por uma concessão do Instituto Nacional de General Medical Ciências, sob 5T32 GM007092 de prêmio.

Dia 1:
1. transiente transfecção de células endoteliais
<ol><li>Se desejado, realizar uma transfecção transiente de humano Umbilical veia endoteliais células (HUVEC) usando oligonucleotídeos gene regulamentares (por exemplo, micro-RNAs ou RNA de interferência pequeno (siRNA)) e o reagente lipofectamine apropriado de acordo com instruções do fabricante. Nota: Este protocolo também teve grande sucesso, realizando transfections reversos com sequências de...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders.">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li><li>Zhang, Z. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+angiogenesis+and+its+assays.">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li><li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis.">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li></ol>

Este protocolo apresenta um método para caracterizar a fases complexas e interacções celulares heterotypic de brotação angiogênese, permitindo que o pesquisador empregar abordagens genéticas e da imagem latente para conduzir investigações mecanicistas minuciosos. Ao realizar o ensaio, é essencial que eficiente revestimento endotelial dos grânulos ocorre durante o grânulo passos de agitação. Revestimento endotelial pobre será feito evidente, se os grânulos parecem não ter uma superfície áspera, como bol...

Angiogênese é vital para a embriogênese apropriado e cicatrização de feridas, e também desempenha papel chave em inúmeras doenças, incluindo câncer doença1 e artéria coronária de progressão. 2 , 3 ter uma melhor compreensão de como a angiogênese ocorre durante o desenvolvimento normal, e como ele é reativado em contextos patológicos, é crítico para o desenvolvimento do romance, terapêutica eficaz. Fiel em vitro modelos que recapitular as etapas importantes e tipos de células envolvidos na angiogênese na vivo são necessários para permitir que os pesquisadores para melhor caracterizar os mecanismos moleculares, dirigindo a angiogênese e fazer novas descobertas no Regulamento endotelial.
Nakatsu e Hughes otimizaram a um ensaio de grânulo brotos que demonstraram ter submetido os vários estágios conhecidos da angiogênese que brota. 4 , 5 o objetivo do método apresentado aqui é construir sobre o ensaio otimizado por Nakatsu e Hughes incorporando perictyes para o ensaio, para que as funções parácrina e juxtracrine de células murais na célula endotelial brotação podem ser incorporadas em estudos de romance angiogênese. Pericitos são células murais que são definidas pelo seu papel como células que mantêm fechem contato físico com células endoteliais devido sua sendo incorporado na membrana vascular do porão. 6 pericitos e células endoteliais engajar em cruz-conversa complexo através de sinalização de vias, incluindo entalhe sinalização, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ e muitos outros. 7 , 8 modelos de Mouse deficientes nessas vias de sinalização demonstram Pericito pobre cobertura de desenvolver vasculatura na embriogênese, levando a remodelação vascular pobre e vasculatura disfuncional. 7 além disso, o papel de pericitos em angiogênese patológica é importante, mas muitas vezes subestimado. Por exemplo, uma característica única da vasculatura do tumor é que os vasos são mais imaturos, gotejantes e disfuncional devido à cobertura de pobre Pericito. 9 foi proposto que a presença ou ausência de pericitos dramaticamente impacta o fenótipo dos vasos sanguíneos do tumor e é um importante mediador das respostas a terapias antitumorais e antiangiogênica. 9 assim, incluindo o papel de pericitos em ensaios em vitro é chave para capturar mais completamente os importantes mecanismos de regulação endotelial.
Embora existam muitos ensaios in vitro e ex vivo atualmente empregados para estudar a angiogênese, existem deficiências a considerar em cada um. Algumas, como a proliferação endotelial e ensaios de migração endotelial, são excessivamente simplificadas e concentrar-se em uma função endotelial em um ambiente isolado na cultura do tecido plástico. 10 outros ensaios ocorrem num mais 3 dimensional (3D) cenário, tais como o ensaio de formação de tubo Matrigel,10 mas estes ensaios são ainda muito simplificados e focar mais na capacidade das células endoteliais, migrar e formar de novo vascular estruturas, em oposição a brotação da vasculatura pré-existente. Além disso, nenhum destes ensaios incorporar tipos de células do mural. Há ex vivo modelos tais como o ensaio de aorta do anel que incorporam pericitos presentes no órgão hospedeiro, mas manipulação genética destes modelos é muito mais difícil devido à necessidade de gerar modelos de rato transgénico ou nocaute do percursos de interesse. O grânulo brotando do ensaio é ideal porque ele modela brotando endotelial, proliferação, migração e formação nem anastomose e lúmen em uma matriz 3D. 4 o ensaio fielmente permite avaliação mecanicista das muitas diferentes fases de brotação, enquanto ainda permitindo a modificação genética direta das células endoteliais ou pericitos em um ambiente mais controlado. Os coágulos de fibrina contendo os grânulos de germinação podem ser facilmente corrigidos, manchados e fotografados em diferentes fases de brotação; esses brotos também podem ser colocados em uma câmara ao vivo de imagem para executar em tempo real imagens de brotação. A metodologia apresentada aqui é ideal para estudar os mecanismos básicos da angiogênese através na fenotipagem de profundidade e análise exaustiva das vias ativado durante a angiogênese.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>HUVEC Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11095114</td>
			<td>10T1/2 Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td>NHLF Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-grade PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>For lifting HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15050065</td>
			<td>For lifting 10T 1/2 and NHLF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customs siRNAs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10T 1/2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHLF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex 3 microcarrier beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>t9549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>a3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator and hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well glass bottom plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G1.513F</td>
			<td>Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtration Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay

Angiogênese é o crescimento de novos vasos da vasculatura pré-existentes e é um importante componente de muitos processos biológicos, incluindo a embriogênese e desenvolvimento, cicatrização de feridas, crescimento tumoral e metástase e doenças oculares e cardiovasculares. Eficaz em vitro modelos que recapitular a biologia da angiogênese são necessários apropriadamente estudar esse processo e identificar mecanismos de regulação que pode, finalmente, ser alvo de novas estratégias terapêuticas. O ensaio de angiogênese grânulo tem demonstrado anteriormente para recapitular os múltiplos estágios de germinação endotelial in vitro. No entanto, uma limitação deste teste é uma falta de endotelial – interações célula mural, , que são fundamentais para a regulação fenotípica e molecular da célula endotelial funcionam na vivo. O protocolo dado aqui apresenta uma metodologia para a incorporação de células murais o ensaio da angiogênese do grânulo e demonstra uma associação apertada de células endoteliais e pericitos durante a germinação em vitro. O protocolo detalha também uma metodologia para a eficaz silenciamento de genes-alvo usando siRNA em células endoteliais para estudos mecanicistas. No total, este protocolo fornece um ensaio em vitro que mais apropriadamente modela os tipos de célula diversos envolvidos na angiogênese de brotação e fornece uma plataforma mais fisiologicamente relevantes para avaliação terapêutica e romance descoberta de mecanismos de regulação de angiogênese.

Este protocolo permite uma associação apertada da dois célula tipos in vitro, e a presença dos pericitos complementa a ocorrência de germinação (figura 1A, B). O protocolo também permite eficaz silencioso (por exemplo, através da interferência do RNA) de um gene de interesse em um tipo de célula de interesse, tais como (VEGFA especificamente nas células endoteliais) ou PDGFRβ em pericitos7</sup...

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Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...