Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke workshop af Biozentrum af Universitet Basel for deres støtte, S. A. Müller for kritiske diskussioner og nøje læsning af manuskript, A. Fecteau-LeFebvre for teknisk bistand med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann for membran protein teste prøver (alt fra C-CINA, Biozentrum, universitetet i Basel) og A. Engel, emeritus Universitet Basel for sin inspirerende samtaler. Prøver var venligst leveret af P. Ringler, M.-A. Mahi, og T. Schwede (Biozentrum, universitetet i Basel), P. Leiman (laboratorium for strukturel biologi og Biofysik, EPFL) og R. Diaz-Avalos (New York strukturel biologi Center, USA). Projektet blev støttet af den schweiziske Nanoscience Institut (SNI, projekt P1401, ARGOVIA projekt MiPIS) og den schweiziske National Science Foundation (SNF, projekt 200021_162521).

<ol>
	<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry:+The+resolution+revolution.">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>Bai, X. -. c., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology.">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li><li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions.">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, 89-102 (1983).</li><li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy.">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li><li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+gun+using+a+field+emission+source.">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li><li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expected+contribution+of+the+field-emission+gun+to+high-resolution+transmission+electron+microscopy.">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li><li>Milazzo, A. -. C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -. H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy.">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li><li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy.">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li><li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -. y., Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors.">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li><li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Cryo-EM+movie+data.">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy.">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy.">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+can+cryo-EM+become.">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li><li>Engel, A., Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+.">in .</a> Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. 96, 417-431 (2010).</li><li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., M&#252;ller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+&#181;-fluidics+to+electron+microscopy.">Connecting &#181;-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy.">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li><li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy.">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li><li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., M&#252;ller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBEB:+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements.">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).</li><li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+interactome:+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy.">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li></ol>

Forfatterne Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg og Thomas Braun erklære følgende konkurrerende finansielle interesser: cryoWriter koncept er en del af patentansøgningen PCT / EP2015/065398 og EP16194230.

'CryoWriter' instrument og de protokoller, der kræves for at forberede prøve gitre for NS - og cryo-EM fra nL størrelse samlede stikprøve diskenheder og helt undgå den klassiske papir-blotting trin præsenteres. Mikrofluid principper og et micromechanical system er kombineret i cryoWriter at gøre dette muligt.
Vores erfaring viser, at når de miniaturized metoder præsenteres i dette håndskrift er anvendt, parameter plads til EM-grid forberedelse er større end for klassiske metoder og under strammere brugerkontrol. Vigtigere, gør øget reproducerbarhed opnåede det muligt at pre-skærm med prøven buffersystem, suppleret med en let tilgængelige test protein til at bestemme de optimale parametre, før den faktiske eksperiment udføres. Dette holder forbruget af stikprøven af interesse til et absolut minimum og kan varmt anbefales. Kritiske trin for både NS og cryo EM gitter forberedelse er: (i) Priming pump system; for sub-nanoliter volumen udlevering, skal systemet væske (vand) være afgassede og boble gratis. (ii) præcis kontrol af glød decharge eller plasma rengøring skridt; gitteret EM overflade egenskaber er afgørende for reproducerbare resultater. (iii) stikprøve conditioning; den tid, der kræves til konditionering, fxmed NS, afhænger på buffer type, salt indhold og koncentration (figur 3), samt på dysen geometri microcapillary24. (iv) fordampning satser for NS-EM forberedelserne til kvantitative EM; kaffe-ring virkning kan forbyde kvantitativ analyse af NS-EM præparater, og skal blive undertrykt ved langsom fordampning satser kontrolleret af DP-scenen.
Forskellige aspekter af præparationsmetoder præsenteres gitter kan kombineres frit, så udviklingen af alsidig protokoller for særlige prøver. Typiske eksempler ville være fjernelse af et stof, der forhindrer høj opløsning EM, fx, glycerol, af en conditioning skridt før gitter forberedelse til cryo-EM; indførelsen af mægleren molekyler, såsom ligander, af conditioning før gitrene tilberedes; eller undersøgelse af enkelt celle lysate af NS - eller cryo-EM (figur 6).
Brugen af mikrofluidik og minimal prøve beløbene i de præsenterede metoder fjerner helt behovet for papir-blotting trin. Dette er en stor fordel, fordi papir blotting er en barsk behandling for proteiner, potentielt forurenende prøve med uønskede ioner og i sagens natur fører til massive prøve tab. På den anden side undgås effekter potentielt forårsaget af grænsefladen luft-vand af tynde prøve filmen dannes når cryo-EM prøver er forberedt på den klassiske måde ikke når cryoWriter der bruges. Grid egnet til cryo-EM kan være forberedt med en mindre end 0,2 s ventetiden mellem eksempelprogrammet og vitrifikation (data ikke vist). Men som proteiner rejser et par tiendedele af et nanometer i et par nanosekunder ved diffusion, der er stadig nok tid for dem til at kollidere med luft-vand-interface af en 100 nm tykke sample film flere gange. Men mængden af proteiner stikning til grænsefladen luft-vand kan reduceres væsentligt ved at fugerne kort tid og kan forhindre protein denaturering eller begrænset partikel orientering. En anden lovende tilgang, der kan beskytte følsomme proteiner fra grænsefladen luft-vand er til at dække sample film af lavmolekylære overfladeaktive stoffer. Disse forbindelser kan indføres hurtigt af en conditioning skridt i cryoWriter før gitter forberedelse. Høj overflade-til-volumen forholdet mellem mikrofluid systemer er en yderligere begrænsning af cryoWriter, som prøven kan potentielt være tabt af uspecifik adsorption til microcapillary overflade og forstyrre kvantitativ analyse af partikel tælling. Problemet er behandlet på to måder: først, prøven ikke rejse lange afstande inden for microcapillary. Faktisk forbliver nanoliter sample volumen på kapillær spidsen under hele behandlingen. Andet overflade til volumen-forholdet reduceres yderligere ved hjælp af microcapillaries med relativt stort indre diameter, fx, 180 µm. for det tredje, overflader på microcapillaries kan let passivated, om nødvendigt, fxved at behandle dem med kommercielt tilgængelige polylysine ethanol glykoler (PLL-PIND).
Høj opløsning analyse af proteiner af enkelt partikel tilgang anvendes i EM kræver kun 100.000 til et par millioner billeder af individuelle protein partikler. Dette betyder, at mikrofluid teknikker kan give nok proteinkomplekser for den strukturelle undersøgelse. En minituariseret immuno-nedbør metode til hurtig isolering af proteinkomplekser (omkring 1 time) fra minimal celle beløb (ca. 40.000 celler) blev udviklet tidligere28. Denne metode vil nu være direkte knyttet til miniaturized prøve forberedelsen af cryoWriter. Det endelige mål er at udvikle en integreret mikrofluid pipeline for ultra-hurtig protein isolation og cryo-EM gitter forberedelse, der kræver mindre end to timer i alt. Desuden, som det fremgår af figur 6, minut mængde og mængden af materiale til forberedelse af prøver og næsten tabsfri conditioning og gitter forberedelse procedure opnås ved hjælp af cryoWriter, gøre det muligt at studere proteinet komplekser af individuelle celler. Sammen, lægge metoden miniaturized immuno-nedbør og cryoWriter fundamentet for en ny proteomics metode kaldet "enkelt celle visuelle proteomics", som vi for nylig demonstreret for heat-shock eksperimenter24. Data analyse algoritmer gearet til analyse af "visual proteomics" billeder er i øjeblikket ved at blive testet.

Hardware og software til strukturel analyse af proteinkomplekser af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) har massivt Avanceret i løbet af de seneste år. Forbedringerne af banet vej for en "resolution revolution"1,2 og fundamentalt ændret strukturelle forskning. Revolutionen begyndte med fremkomsten af cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM)3,4, giver mulighed for forberedelse af biologiske prøver under tæt på fysiologiske tilstande samtidig reducere stråling følsomhed og forebygge prøven fordampning i det høje vakuum transmissions-elektronmikroskop5. I de følgende år øget incremental teknologiske fremskridt gradvist opløsning opnåelige. Blandt disse nyskabelser var anvendelsen af felt-emission kanoner6,7, og for nylig forbedret data analyse algoritmer, som højst sandsynligt metoder8,9. Direkte elektron detektor kameraer10,11,12,13, filmtilstand imaging og medfølgende software udvikling14,15, 16 , 17, forudsat det endelige gennembrud kræves for at opnå atomare opløsning for biologiske prøver af enkelt partikel analyse (for en anmeldelse Se Cheng, Grigorieff, et al. 18). betydningen af cryo-EM blev for nylig anerkendt ved tildelingen af Nobelprisen i kemi for tre af pionererne.
For at billedet en biologisk prøve af TEM, metoden bruges til at indlæse EM gitter med prøve (efterfølgende benævnt "gitter forberedelse") skal sikre, at det resulterende udsnit lag (i) er tynd nok (< 100 nm) at undgå omfattende støj af uelastisk eller formere sig spredt elektroner, (ii) tåler den høje tomrum af elektron mikroskop, og (iii) beskytter biomolekyler mod strålingsskader. To vigtigste metoder der anvendes til at opfylde disse Sportel: Negative pletten(NS)19,20 procedurer (fig. 1A) adsorberes prøven til en tynd carbon film, integrere biomolekyler i amorfe heavy metal og derefter Tillad forsamlingen til at tørre i luften. Dette er enkel og hurtig, og de indlæste EM gitre (efterfølgende benævnt "prøve gitre") er let at gemme og kan opbevares i længere tid (normalt år). I TEM, forberedelserne udviser stor kontrast på grund af NS og tolererer højere elektron doser end cryo-præparater, men beslutningen er begrænset til ca. 20 Å. Cryo-EM procedurer (fig. 1B) ansætte holey carbon understøtter. En tynd film af prøveopløsningen er strakte sig tværs over hullerne og gitteret EM er kastet ud i en cryogen, normalt flydende Ethan, hurtigt afkøles det under-150 ° C. Resultatet er en amorf, forglasset, 50 til 100 nm-tyk film af løsningen i støtte huller. Denne tynde, amorfe film tåler høje vakuum i elektron mikroskop og, i det ideelle tilfælde bevarer biologiske strukturer i deres hjemstat. Proceduren giver mulighed for biologiske prøver at blive afbildet på høj opløsning. Dog skal gitteret prøven opbevares ved temperaturer nedenfor-150 ° C på alle tidspunkter for at undgå devitrification. Det kan være afbildet med forholdsvis høj elektron doser på grund af den lave temperatur, men kontrasten og signal / støj-forhold er imidlertid lavt. Derfor gennemsnit teknikker er ansat til at øge kontrasten, og forudsat at stikprøven er afbildet fra forskellige vinkler, en høj opløsning tredimensional (3D) kort kan rekonstrueres. De mest almindeligt anvendte og meget vellykket metode til 3D rekonstruktion allerede nu er metoden med enkelt partikel. En nylig gennemgang, finder Cheng på al.18.
Negative pletten TEM (NS-EM) er vigtigt for screening og kvalitetskontrol, når høj kontrast er nødvendig, eller når kun begrænsede mængder af prøven er tilgængelige (adsorption til carbon film generelt koncentrerer prøven). Enkelt partikel cryo-EM er guld-standard metode hvis høj opløsning 3D rekonstruktioner af protein struktur er rettet til.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Figur 1: principper af TEM gitter forberedelse og sammenligning mellem klassisk (panelet A, B) og en mikrofluid tilgang (panel C, D). A) klassisk NS-EM gitter forberedelse: om 3 µL af prøven er pipetted i hånden på en EM gitter dækket med en kontinuerlig carbon film (efterfølgende benævnt en 'NS-EM grid') (i). Efter inkubation i ca. 10 s, filtrerpapir bruges til at skamplet væk den overskydende væske fra side (ii), forlader den adsorberede biomolekyler i en tynd vand film. Efterfølgende, proteinet er inkuberes i en heavy metal saltopløsning, f.eks., 2% uranyl acetat, for 20 s (iii), og igen væsken fjernes ved at duppe fra side ved hjælp af filtrerpapir (iv). Endelig, EM-grid er overladt til tørre i luften. B) klassisk cryo-EM gitter forberedelse: om 3 µL af prøven er pipetted af en hånd på en film fra holey kulstof. For at danne en tynd sample film, fjernes den overskydende væske ved papir-duppe ansigtet-på fra én eller begge sider (ii). Endelig er nettet hurtigt kastet ud i flydende Ethan for forglasning (iii). C) NS-EM gitter forberedelse ved hjælp af opsætningen af cryoWriter: A 5 nL volumen er indsugning fra prøve lager ved hjælp af en microcapillary, (i). For eksempel conditioning, er microcapillary spidsen nedsænket i conditioning løsning, fx2% ammoniumacetat. Ioner og små molekyler der udveksles ved diffusion (ii). Bemærk, at dimensionerne af microcapillary sikre, at hele processen er diffusion drevet. Proteiner har meget lavere diffusion konstanter end salt ioner og er ikke betydeligt tabt24. Endelig er prøven udleveres på nettet og lov til at tørre (iii). D) principper af cryo-EM gitter forberedelse ved hjælp af cryoWriter-baseret metode: en EM gitter dækket med en holey carbon film er placeret på overfladen af en temperatur-kontrollerede platform og besiddelse af pincet. Platformen er Temperaturstyret ved en forskydning fra dugpunkt temperatur af nettet miljøet. Gitteret er flyttet i forhold til den microcapillary, der indeholder prøven og microcapillary sænkes, indtil det er nogle få mikrometer over nettet. Efterfølgende, er et par nanoliters af prøven udleveret fra det mens scenen er flyttet i en spiral mønster; overskydende væske er re indsugning (i). Efter EM gitter grunding, microcapillary er trukket tilbage og gitteret forbliver på den temperatur kontrollerede platform (efterfølgende benævnt dugpunkt (DP) fase) for en kort tid at give en kontrolleret mængde af prøven til at fordampe. For springet frysning, er gitteret hurtigt trukket tilbage fra scenen med pincet (ii), vendt 90 ° til lodret position og kastet ud i en cryogen bad (iii) (efterfølgende benævnt 'pick-og-springet' mekanisme). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Desværre, forbedret gitter forberedelse metoderne til NS og cryo-EM har ikke væsentligt, siden de blev opfundet. Nuværende ulemper er høj sample forbrug (ca. 3 µL af protein, 1 mg/mL) og den store mængde (> 99%) af prøven mistede (figur 1A, B). Desuden, den klassiske metode bruges til at forberede cryo-EM gitre er en barsk procedure for proteiner: først, det indebærer en omfattende ansigt-på papiret-blotting trin (figur 1B, ii), og det andet protein er udsat for luft-vand-grænseflade for en betydelig mængde tid21. Her, en alternativ metode til prøven forudgående konditionering, prøve gitter forberedelse og efterbehandling (gitter tørring eller vitrifikation) for NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (fig. 1D) er præsenteret. Den in-house bygget setup, kaldet "cryoWriter", bruger miniaturized prøve håndtering teknologi og mikrofluid principper Aspirér, tilstand og give afkald på prøve, undgå papir blotting helt og at give alternative metoder til tynde prøver for Cryo-EM. Det betydeligt reducerer forbruget af prøven og forbedrer bruger-kontrol over prøveforberedelse som helhed. Desuden metoden giver mulighed for nye eksperimentelle programmer; forberedelse af isolerede biologiske komponenter af individuelle celler i en tilgang, kaldet "enkelt celle visuelle proteomics"22,23,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

På grund af de seneste teknologiske fremskridt, kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er hurtigt ved at blive en standard metode til den strukturelle analyse af proteinkomplekser til atomic opløsning. Protein isolation teknikker og prøve præparationsmetoder for EM er dog stadig en flaskehals. Et relativt lille antal (100.000 til et par millioner) af individuelle protein partikler skal være afbildet til høj opløsning analyse af proteiner af enkelt partikel EM tilgang, at gøre miniaturized prøve håndtering teknikker og mikrofluid principper muligt.
En minituariseret, papir-blotting-gratis EM gitter forberedelse metode for prøven før conditioning, EM gitter priming og efterbehandling, der kun forbruger nanoliter-mængder af prøven er præsenteret. Metoden bruger en udlevering system med sub-nanoliter præcision kontrol flydende udbredelse og EM gitter priming, en platform til at styre den gitter temperatur derved bestemme relative luftfugtigheden over gitteret EM, og en pick-og-springet-mekanisme for prøve vitrifikation. Til cryo-EM, en EM gitter er placeret på den temperatur-kontrollerede fase og prøven er indsugning i et kapillarrør. Kapillar spidsen er placeret i nærhed af gitter overflade, gitteret er fyldt med prøven og overskydende er re indsugning i microcapillary. Efterfølgende er prøve film stabiliseret og lidt tyndet af kontrolleret vand fordampning reguleret af forskydningen af platform temperaturen i forhold til Dugpunktet. På et givent tidspunkt udløses pick og springet mekanisme, hurtigt overføre PRIMES EM gitteret til flydende Ethan for prøven vitrifikation. Alternativt findes prøve-conditioning metoder at forberede negative pletten (NS) EM nanoliter mellemstore prøve diskenheder.
Metoderne, der kraftigt reducere prøve forbrug og undgå tilgange potentielt skadelige til proteiner, såsom filtrerpapir blotting anvendes i konventionelle metoder. Derudover minuscule mængden af prøven kræves giver mulighed for nye eksperimentelle strategier, såsom hurtig prøve conditioning, kombination med én celle lysis for "visuelle proteomics" eller "lossless" samlede prøveforberedelse til kvantitativ analyse af komplekse prøver.

Opsætningen af "cryoWriter" blev udviklet (skildret i figur 2) for at teste de miniaturized EM gitter forberedelse procedurer foreslås i figur 1C, D. Figur 2 A viser en oversigt over de forskellige komponenter monteret på en invers fluorescens mikroskop. En dyrkning af celle-modulet er installeret på den venstre side af mikroskopet; et modul til EM gitter forberedelse er placeret til højre. Modulet celle-dyrkning (figur 2B) giver mulighed for vækst af vedhængende eukaryote celler og live-celle billeddannelse af cellekultur af den lysmikroskop. Individuelle celler er mængden af den kombinerede virkning af osmotisk chok, elektroporation og aspiration af celleindhold ind i en microcapillary (figur 2B, fig. 6A)24,25. Indsugning lysate prøven kan derefter bruges til at forberede gitre for NS - eller cryo-EM. Alternativt kan en materiel protein løsning i et PCR rør være eksempelkilden. Microcapillary (figur 2B) ansat er forbundet til et high-precision pumpesystem tillader prøve diskenheder til indsugning og undværes sub-nL præcision. Som beskrevet i protokollerne udføres alle prøve forarbejdning inden for denne microcapillary eller på EM gitteret, selv uden betydelige prøve transport. For eksempel, bruges den samme microcapillary til at lyse individuelle eukaryote celler, Opsug den lysate, betingelse det og endelig dispensere delprøver på EM gitre. Gitter forberedelse modul består af en bevægelig DP-fase, der giver mulighed for temperaturen i EM gitteret placeret på det at være netop kontrollerede (figur 2C). For NS-TEM, kan den forbehandlede prøve gitter derefter simpelthen fjernet fra den kolde fase og lov til at tørre i luft ved rumtemperatur. De såkaldte kaffe-ring virkninger, der kan derefter følge skal imidlertid undgås for kvantitative TEM hvor protein 'partikler' tælles. At gøre det, gitre er tørret langsomt på DP-scene ved hjælp af en gradvis stigende temperaturgradient for at bremse flydende fordampning. Til cryo-EM holdes temperatur af gitteret tæt på dugpunkt; en positiv forskydning på ca 8 ° C er valgt, giver mulighed for kontrolleret fordampningen af prøven væske til tynde film stabilisering og udtynding, som kan overvåges af en sensor, eventuelt26. Efter den valgte tyndere tid, en pick og springet mekanisme er aktiveret og prøven er forglasset (figur 2C). Bemærk at denne styrter mekanisme ikke er nødvendig for NS-EM gitre, som oplagres ved stuetemperatur.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig2.jpg"> Figur 2: oversigt over opsætningen af cryoWriter. A) oversigt over opsætningen cryoWriter monteret på en invers lys-mikroskop (1). B) indsatser på området angivet i venstre side i panelet A. celle dyrkningsbaserede rum (2), med en microcapillary (3) for eksempel manipulation og celle lysis placeret over en minituariseret PDMS-baserede celle kultur plade (4). C) indsatser på området angivet til højre i panelet A. 'Pick-og-springet' mekanisme. En holey carbon film EM gitter (5) er monteret mellem tips pincet (6) og placeret vandret i direkte kontakt med den temperatur-kontrollerede fase (7), nævnt som dugpunkt fase (DP-fase) i hovedteksten. Fase temperatur er stramt kontrolleret via en PID-controller og en vandkølet Peltier-element, at holde det på eller tæt på dugpunkt-temperaturen, afhængigt af det omgivende miljø. DP-fase (7) er monteret på en motoriseret xy-akse til at flytte grid i forhold til microcapillary. Microcapillary selv kan er monteret på en z-fase og sænkes indtil det er meget tæt på overfladen af gitteret EM og bruges til at give afkald på nanoliter mellemstore systemdiskenhederne til prøven støtte dækker det (en kontinuerlig tynd carbon lag for NS-EM eller en holey carbon film for cr yo-EM). Bemærk, at flydende udbredelse og udlevering udføres, ved hjælp af en high-precision pumpesystem (8). Dosisdispenserede væsken kan distribueres ved at flytte grid i forhold til microcapillary i en spiral mønster. Til cryo-EM forberedelse overfører pluk og springet dybfrysning mekanismen (9) hurtigt gitteret prøve-loaded i flydende Ethan (10) for hurtig nedkøling og prøve vitrifikation. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Figur 3 viser repræsentative resultater for NS-EM gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter. Spidsen af microcapillary var fyldt med 5 nL prøve fra en stamopløsning og dyppet i et reservoir af NS løsning (2% methylamin tungstate) til flere minutter at tillade diffuserende udveksling af NS og salt ioner (for en teoretisk diskussion Se Arnold, et al. 24). bagefter, konditioneret prøven blev udleveret på tynd carbon folie af en NS-EM gitter og tørret. Figur 3 A viser brugen af et slot gitter på den samme måde at visualisere den komplette droplet, som kræves for kvantitative TEM. For at undgå kaffe ring virkning, var frisk glød-udledes nettet oprindelig blev afholdt på dugpunkt temperaturen (ingen vand fordampning) og derefter langsomt varmede på DP-scenen. Bemærk, at for de fleste programmer (f.eks., kvalitetskontrol af prøven eller strukturel analyse) denne langsomme-tørring proces ikke er nødvendig. Lang-seriøs NS-præparater er fremstillet uden det, som vist i figur 3B, C. Conditioning gange for fosfatfri lav salt buffere er omkring 3 min, fxmed lavt saltindhold Tris-buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4 med 50 mM NaCl), som vist i figur 3B ved hjælp af tobak mosaik virus (TMV) som eksempel. Figur 3 C præsenterer et worst-case scenario, som TMV var i PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4). Fosfat-ioner danne forbigående krystaller med heavy-metal-ioner af NS (Se figur 5C), forlængelse conditioning tid kræves (7 min). Andre heavy metal salte kan også bruges med gitter forberedelse modul, f.eks., 2% methylamin vanadate eller ammonium molybdat (Se også Arnold, et al. 24). uranyl acetat er imidlertid ikke passende; crosslinking virkningen af denne plet fører til aggregater Hvis eksemplet protein der er konditioneret i løsning, før adsorption til en kulstof film (Se figur 5E)23.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig3.jpg"> Figur 3: typiske resultater for NS gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter, som angivet i figur 1C. A) oversigt over billedet af en 3 nL droplet udleveret på et slot gitter efter konditionering med 2% methylamin tungstate. B) TMV i 20 mM TRIS buffer. Indsatsen viser en 3 x udvidelsen af det angivne område. Tilpasset fra Arnold, et al.24 (yderligere tilladelser vedrører materialet excerpted skal rettes til ACS). C) tobak mosaik virus (TMV) i PBS buffer. Indsatsen viser en 3 x udvidelsen af det angivne område. Tilpasset fra Arnold, et al.24 (yderligere tilladelser vedrører materialet excerpted skal rettes til ACS). Skalere barer: A, 100 µm; B, 50 nm; Christensen, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Typiske resultater for cryo-EM gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter er afbildet i figur 4. Panelet 4A viser et gitter atlas af området er omfattet af forglasset prøve. Panelet 4B viser homogeniteten af glasagtige isen i en slot, valgte gitter. I begge tilfælde var prøven i 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM NaCl buffer indeholdende 0,05% Fos 14 vaskemiddel. Mange prøver og buffere blev testet og en tilsvarende høj kvalitet glasagtige is var fremstillet, men betingelserne er buffer afhængige (Se også diskussion af figur 5). Panel 4C viser apoferritin partikler og en bacteriophage i Tris-HCl buffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4) afbildet på høj defocus at øge kontrasten. Panel 4D viser en 200 kDa membran protein stabiliseres af amphipoles.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig4.jpg"> Figur 4: typiske resultater for cryo-EM gitre udarbejdet ved hjælp af opsætningen af cryoWriter, som angivet i figur 1D. Prøverne og buffere varierer i eksempler vist. Alle prøver blev indlæst på holey carbon film. A) Collage af oversigt billeder ("grid atlas") af en prøve, der indeholder en 150 kDa membran protein, i periferien af den glasagtige is er angivet med hvide pile. B) udvidede gitter slot fra et gitter, tilberedt med de samme buffer, viser holey carbon film med glasagtige is. Nogle huller er ikke fyldt med prøvebuffer som anført af hvide pile. C) Carbon hul med forglasset prøve indeholdende apoferritin proteinkomplekser og Bakteriofager. Indsatser: dobbelt udvidelsen viser halen af en bacteriophage. Den hvide stjerne angiver carbon film. Bemærk, at billedet er optaget med høj defocus at øge kontrasten. D) A 200 kDa membran protein fremstillet i amphipols. Indsatser: en 2 x udvidelsen af den angivne område med øget kontrast. Skalere barer: A, 100 µm; B, 10 µm; C og D, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Opsætningen af cryoWriter giver mulighed for systematiske screening for optimal EM-grid forberedelse betingelser; et eksempel er vist i figur 5A (apoferritin i 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,05% Fos 14). I dette eksperiment, den glasagtige ice "tyndere" temperatur blev varieret, men den tyndere tid (dvs., tidsforskydninger mellem eksempelprogrammet og springet frysning) forblev konstant (1 s). Ved lave offset temperaturer (f.eks., 8 K) var prøve lag for tyk. Ved højere temperaturer, offset, den glasagtige isen i hullerne var tyndere (10 K, 12 K), indtil på et tidspunkt (over 18 K) gitteret blev helt tør (ikke vist). I resultaterne præsenteres her, en forskydning af 12 K fører til et stort homogene område af glasagtige is som angivet af de sorte pile. Sådanne optimeringseksperimenter kan udføres med buffer af målstikprøven ved hjælp af "teste" proteiner (såsom apoferritin). De bedste betingelser fundet anvendes derefter på målstikprøven. Derudover gitre med parametre langt fra optimalt kan ofte være anerkendt under forberedelse procedure og behøver ikke at blive screenet i elektronmikroskop, betydelig tidsbesparelse. Figur 5 viser også et galleri af typiske cryo-EM (Panel B) og NS-EM (paneler C e) artefakter specifikke til opsætningen af cryoWriter. Cryo-EM gitteret vises i panelet 5B med TMV i PBS, som indeholder 0,1% decyl-β-D-maltopyranoside (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4, 0.1%DM) var overdrevent tyndet. På baggrund af billedet er kornet, fordi den saltkoncentration blev for høj. Generelt er synes det visuelle udseende af en prøve ikke at være en lineær funktion af saltkoncentration; korn bliver pludselig fremtrædende, når en tærskelkoncentration nås under udtynding proces. Bemærk, at uønskede stoffer kan fjernes ved en conditioning skridt før gitter forberedelse, som beskrevet for NS-EM i protokollens punkt 1.6. NS kan forårsage andre artefakter. I eksemplet vises i panelet 5C, PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) uden prøve var konditioneres i 2% methylamin tungstate i 3 min. bundfald og krystaller er indlysende og udøve omfattende styrker på carbon overfladen fører til revner. Formen bundfald kun i en vis PBS og NS koncentration rækkevidde og kan undgås ved conditioning eksempel for længere (Sammenlign figur 3C). Panel 5D viser i periferien af en dosisdispenserede NS prøve droplet udstiller et "kaffe ring". Dette ville forstyrre kvantitative, samlede stikprøve analyse og kan undgås ved at bremse tørringsproces, dvs., ved at holde EM gitteret ved temperaturen, dugpunkt under eksempelprogram, og derefter gradvist øge temperaturen for at tørre det) Se fig. 3A). Panelet 5E (apoferritin i 20 mM HEPES, pH 7,0, konditioneret 3 min) viser crosslinking aktiviteten af 2% uranyl acetat plet, som ikke kan bruges til betingelse protein prøver, før de er adsorberet til carbon film understøtter.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig5.jpg"> Figur 5: systematiske ændringer og artefakter observeret Hvornår cryoWriter set-up blev brugt til at forberede gitre for NS - og cryo-EM. A) systematisk glasagtige is tykkelse variation; optimering af gitter forberedelse til cryo-EM. Offset temperaturen i DP-scenen var varieret (8-12 omdr) at holde de tyndere tidsvejning (1 s). Pilene angiver i periferien af prøven lag. B) Salt virkninger; for koncentreret, var dvsdet tyndere skridt for lang tid. Indsatsen skildrer en 2 x udvidelsen af det angivne område. C) Salt bundfald dannet af PBS buffer i overværelse af tungmetal salte. Prøver som indeholder PBS buffer skal konditioneres længere end prøver i andre buffere. Her, var PBS buffer uden prøve aircondition i 2% methylamin tungstate i 3 min, en typisk tid til andre prøve buffere. Bemærk knæk i carbon filmen sandsynligvis på grund af de stærke kræfter fra bundfald handler på den tynde støtte under tørringen. D) 'Kaffe ring' effekt. E) Apoferritin aircondition i 2% uranyl acetat for 3 min. Uranyl ioner udviser betydelig crosslinking aktivitet og apoferritin klynger form store aggregater. Skalere barer: A, 80 µm; B, 80 nm Christensen, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Den lille mængde og volumen kræves til EM gitter forberedelse ved hjælp af opsætningen af cryoWriter gør det muligt for nye typer af eksperimenter. For eksempel kan de samlede indhold af en enkelt celle indsamlet og udarbejdet for NS - og cryo-EM. Proceduren, der er angivet i figur 6A. En vedhængende, eukaryote celle (HEK 293) er mængden af samtidige elektroporation og prøve aspiration (Panel 6A)25. En samlet maengde paa 3 nL er indsugning, som indeholder cellen lysate, og er bevaret i microcapillary til videre bearbejdning. For NS-EM vist i panelet 6B, blev celle dyrkning mediet udvekslet med PBS buffer (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) før celle lysering. Indholdet af cellen var indsugning i 3 nL buffer og aircondition i et reservoir af NS som angivet i figur 1C i 10 min. bagefter, et 5 nL volumen var udleveret på kontinuerlig carbon folie af en NS-EM gitter. Individuelle proteiner, fx, trådformede actin og membran pletter med vedlagte proteiner kan genkendes i billedet. Til cryo-EM, vist i figur6 C, et volumen på 3 nL blev udleveret på et holey carbon EM gitter uden fornyet ønske om at fjerne væske. Den forholdsvis tyk film af prøven dannet blev udførligt tyndet før vitrifikation. For at gøre det, var DP-fase temperatur gradvist øget, startende fra dugpunkt temperaturen. Den udtynding proces blev overvåget af en real-time sensorsystem, indtil en forhånd fastsat grænse var nået udløser 'pick-og-springet' mekanisme og prøve vitrifikation (for detaljer se Arnold, et al. 26). membran strukturer og proteiner kan genkendes i billedet.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig6.jpg"> Figur 6: enkelt celle visuelle proteomics ved hjælp af cryoWriter set-up. A) Lysis af en enkelt vedhængende eukaryote celle. Cellen er vokset (1, grøn) på en functionalized, ITO belagt (rød) glas-dias (2) i en minituariseret petriskål (3)25. Laget ITO er jordforbundet. Cellen er kontaktet af microcapillary (4), som er belagt med platin. En første osmotisk chok (ikke angivet) er givet til lette lysis, som udføres af en række elektriske impulser og shear styrker udøves under aspiration af cellen lysate. Processen kan overvåges af lysmikroskopi; mål linsen af mikroskopet er angivet (5). For detaljer, se vores tidligere arbejde24,25. B) NS-EM billede af lysate fra en enkelt HEK 293 celle. Trådformede aktin og membran pletter med vedlagte proteiner er synlige. Panelet tilpasset fra Arnold, et al.24 (yderligere tilladelser vedrører materialet excerpted skal rettes til ACS). C) Cryo-EM billede af lysate fra en enkelt HEK 293 celle. Indsatsen viser en 2 x udvidelsen af den angivne region hvor typisk membran strukturer med tilhørende proteiner er synlige. Panelet C tilpasset fra Arnold, et al. 26 skala barer: B, 50 nm; Christensen, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Et instrument og metoder til udarbejdelse af nanoliter mellemstore prøve diskenheder for transmissions Elektron Mikroskopi er præsenteret. Ingen papir-blotting trin er påkrævet, således at man undgår de skadelige konsekvenser dette kan have for proteiner, betydeligt reducere prøve tab og muliggør analysen af enkelt celle lysate for visuel proteomics.

Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

SKAL og MÅ af Cryo-elektronmikroskopi: En primer på Prøveforberedelse og data af høj kvalitet Indsamling til Macromolecular 3D Genopbygning

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Nedfrysning: Et værktøj for Ultrastrukturelle og immunlokalisering Studier af Suspension Celler i Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Forberedelse og Observation af Thick Biologiske prøver ved scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...