Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

De auteurs bedank de workshop van de Biozentrum van de Universiteit van Bazel voor hun steun, S. A. Müller voor kritische discussies en zorgvuldig lezen van het manuscript, A. Fecteau-LeFebvre voor technische bijstand met EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann voor membraan eiwit testen monsters (alle uit de C-CINA, de Biozentrum, de Universiteit van Bazel) en A. Engel, emeritus Universiteit Bazel voor zijn inspirerende gesprekken. Monsters werden beschikbaar gesteld door P. Ringler, M.-A. Mahi, en T. Schwede (Biozentrum, Universiteit van Bazel), P. Leiman (laboratorium van structurele biologie en biofysica, EPFL) en R. Diaz-Avalos (structurele biologie Center, USA New York). Het project werd ondersteund door het Zwitserse Nanoscience Instituut (DNI, project P1401, ARGOVIA project MiPIS) en de Zwitserse National Science Foundation (SNF, project 200021_162521).

<ol>
	<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry:+The+resolution+revolution.">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>Bai, X. -. c., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology.">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li><li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions.">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, 89-102 (1983).</li><li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy.">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li><li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+gun+using+a+field+emission+source.">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li><li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expected+contribution+of+the+field-emission+gun+to+high-resolution+transmission+electron+microscopy.">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li><li>Milazzo, A. -. C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -. H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy.">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li><li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy.">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li><li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -. y., Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors.">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li><li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Cryo-EM+movie+data.">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy.">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy.">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+can+cryo-EM+become.">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li><li>Engel, A., Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+.">in .</a> Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. 96, 417-431 (2010).</li><li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., M&#252;ller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+&#181;-fluidics+to+electron+microscopy.">Connecting &#181;-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy.">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li><li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy.">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li><li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., M&#252;ller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBEB:+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements.">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).</li><li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+interactome:+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy.">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li></ol>

De auteurs Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg en Thomas Braun verklaren de volgende concurrerende financiële belangen: het cryoWriter-concept is onderdeel van de aanvrage om octrooi PCT / EP2015/065398 en EP16194230.

De 'cryoWriter'-instrument en de protocollen die zijn vereist voor het bereiden van monster rasters voor NS - en cryo-EM van nL grootte totale steekproef volumes en helemaal vermijden de klassieke papier-bevlekken stap worden gepresenteerd. Microfluidic beginselen en een micromechanische systeem zijn gecombineerd in de cryoWriter dit mogelijk te maken.
Onze ervaring leert dat wanneer de verkleinde methoden gepresenteerd in dit manuscript worden gebruikt, de parameter ruimte voor de voorbereiding van de EM-raster groter dan voor de klassieke methoden, en onder strengere controle van de gebruiker is. Nog belangrijker is, maakt de verhoogde reproduceerbaarheid bereikt het mogelijk om vooraf te controleren met monster buffersysteem, aangevuld met een eiwit beschikbaar test, om te bepalen van de optimale parameters voordat het werkelijke experiment is uitgevoerd. Dit houdt van consumptie van het monster van belang tot een absoluut minimum en wordt sterk aangeraden. Kritische stappen voor de voorbereiding van beide NS - en cryo-EM raster zijn: (i) Priming van de pompsysteem; met betrekking tot sub-nanoliter volume aflevering, moet het systeem vloeistof (water) worden ontgaste en gratis bubble. (ii) nauwkeurige controle van de gloed lozing of plasma schoonmaken stap; de oppervlakte kenmerken van het EM-raster zijn cruciaal voor reproduceerbare resultaten. (iii) monster conditionering; de tijd die nodig is voor het conditioneren, bijvoorbeeldmet de NS, hangt af van de aard van de buffer, de zoutgehalte en de concentratie (Figuur 3), en op de geometrie van het mondstuk van de microcapillary24. (iv) de verdampingssnelheden voor NS-EM preparaten voor kwantitatieve EM; de koffie-ring effect kan verbieden de kwantitatieve analyse van NS-EM preparaten, en moet worden onderdrukt door langzame verdampingssnelheden gecontroleerd door de DP-fase.
Verschillende aspecten van de gepresenteerde raster bereidingswijzen kunnen vrij worden gecombineerd waardoor de ontwikkeling van veelzijdige protocollen voor specifieke monsters. Typische voorbeelden zou de schrapping van een stof die hoge resolutie EM, bijvoorbeeld, glycerol, door een conditionering stap vóór raster voorbereiding voor cryo-EM voorkomt; de invoering van bemiddelaar moleculen, zoals liganden, door conditionering voordat de rasters worden bereid; of het onderzoek van eencellige lysate door NS - of cryo-EM (Figuur 6).
Het gebruik van microfluidics en minimal steekproef bedragen in de gepresenteerde methoden elimineert volledig de noodzaak voor papier-bevlekken stappen. Dit is een groot voordeel, want papier bevlekken een harde behandeling voor eiwitten is, potentieel verontreiniging van de steekproef met ongewenste ionen en inherent leidt tot massale monster verlies. Aan de andere kant, effecten, mogelijk veroorzaakt door de lucht-water-interface van de dunne monster film gevormd wanneer cryo-EM monsters zijn voorbereid op de klassieke manier niet vermeden wanneer de cryoWriter wordt gebruikt. Rasters geschikt voor cryo-EM kunnen bereid worden met een wachttijd van minder dan 0,2 s tussen voorbeeldtoepassing en verglazing (gegevens niet worden weergegeven). Als een paar tienden van een nanometer in een paar nanoseconden eiwitten door diffusie reizen, is er echter nog steeds genoeg tijd voor hen te botsen met de interface van de lucht-water van een 100 nm dikke monster film meerdere malen. Echter, de hoeveelheid eiwitten die vasthouden aan de lucht-water-interface kan aanzienlijk worden verkleind door deze korte tijd leemten en ertoe leiden dat denaturatie van eiwit of particle oriëntatie beperkt. Een andere veelbelovende aanpak die gevoelige eiwitten voor de lucht-water-interface behoeden kan is ter dekking van de film monster door laag molecuulgewicht tensioactieve stoffen. Deze verbindingen kunnen snel worden ingevoerd door een stap van de conditionering in de cryoWriter voor de bereiding van het raster. De hoge verhouding van oppervlakte-naar-volume van microfluidic systemen is een verdere beperking van de cryoWriter, zoals monster potentieel kan worden verloren door aspecifieke adsorptie aan de oppervlakte van de microcapillary en verstoren van kwantitatieve analyse door het tellen van deeltjes. Het probleem is gericht op twee manieren: ten eerste, het monster doet niet reizen lange afstanden binnen de microcapillary. Inderdaad, het monstervolume nanoliter blijft op de capillaire tip tijdens de verwerking. Ten tweede: de oppervlakte volumeverhouding is verder verminderd door het gebruik van microcapillaries met relatief grote innerlijke diameters, b.v., 180 µm. ten derde, de oppervlakken van de microcapillaries kunnen gemakkelijk worden gepassiveerd, indien nodig, bijvoorbeelddoor ze te behandelen met verkrijgbare polylysine ethanol glycolen (PLL-PEG).
De hoge resolutie analyse van eiwitten door de aanpak van één deeltje gebruikt in EM vereist slechts 100.000 tot een paar miljoen beelden van individuele eiwit deeltjes. Dit betekent dat microfluidic technieken genoeg eiwitcomplexen voor de structurele onderzoek bieden kunnen. Een verkleinde immuno-neerslag-methode voor de snelle isolatie van eiwitcomplexen (ongeveer 1 uur) van minimal cel bedragen (ca. 40.000 cellen) werd eerder28ontwikkeld. Deze methode zal nu direct worden gekoppeld aan de fase van de bereiding van het verkleinde monster van de cryoWriter. Het uiteindelijke doel is het ontwikkelen van een pijpleiding van de geïntegreerde microfluidic voor ultrasnelle eiwit isolatie en cryo-EM raster voorbereiding, waarvoor minder dan twee uur in alle. Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 6, het minieme bedrag en de hoeveelheid materiaal dat nodig is voor de bereiding van de monsters en de bijna lossless airconditioning en raster voorbereiding procedure bereikt met behulp van de cryoWriter, het mogelijk maken te bestuderen van het eiwit complexen van afzonderlijke cellen. Samen de verkleinde immuno-neerslag-methode en de cryoWriter de basis leggen voor een nieuwe proteomics methode genaamd "eencellige visuele proteomics", zoals we onlangs aangetoond voor warmte-schok experimenten24. Data analyse algoritmen gericht op de analyse van "visuele proteomics" beelden worden momenteel getest.

Hardware en software voor de structurele analyse van eiwitcomplexen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) heeft massaal op vooruit gegaan gedurende de afgelopen jaren. De verbeteringen die zijn aangebracht aan een "resolutie revolutie"1,2 geëffend en fundamenteel veranderd structurele onderzoek. De revolutie begon met de komst van cryo-Elektron microscopie (cryo-EM)3,4, zodat de voorbereiding van biologische monsters onder dichtbij fysiologische omstandigheden terwijl het verminderen van de gevoeligheid van de straling en het voorkomen van de verdamping van het monster in de hoog vacuüm van de transmissie elektronenmicroscoop5. In de daaropvolgende jaren verhoogde incrementele technologische vooruitgang geleidelijk de resolutie haalbaar. Onder deze innovaties waren de toepassing van veld-emissie kanonnen6,7, en, meer recentelijk, verbeterd data analyse algoritmen, zoals maximale waarschijnlijkheid methoden8,9. Directe elektron detector camera's10,11,12,13, filmwijze beeldvorming en de bijbehorende software ontwikkelingen14,15, 16 , 17, verstrekt de definitieve doorbraak verplicht te bereiken van atomaire resolutie voor biologische monsters door één deeltje analyse (Zie voor een overzicht Cheng, Grigorieff, et al.. 18). het belang van cryo-EM werd onlangs erkend door de toekenning van de Nobelprijs voor de Scheikunde tot drie van de Pioniers.
Naar een biologische steekproef door TEM image, de methode gebruikt voor het laden van het EM-raster met monster (hierna "raster voorbereiding" genoemd) moet ervoor zorgen dat de resulterende monster laag (i) dun genoeg (< 100 nm) te vermijden veelomvattend rumoer door inelastisch of vermenigvuldigen verspreid elektronen, (ii) het hoog vacuüm van de elektronenmicroscoop doorstaat, en (iii) de biomoleculen beschermt tegen schade door straling. Twee belangrijkste methoden worden gebruikt om te voldoen aan deze voordelen: negatieve vlek(NS)19,20 procedures (Figuur 1A) adsorberen van het monster, tot een dunne koolstof-film, de biomoleculen insluiten in amorfe heavy metal en vervolgens toestaan dat de vergadering te drogen in de lucht. Dit is eenvoudig en snel, en de geladen EM rasters (hierna "monster rasters" genoemd) zijn gemakkelijk te slaan en kan worden gehouden voor langere tijd (meestal jaren). In TEM, de voorbereidingen vertonen hoog contrast als gevolg van de NS en tolereren van hogere doseringen van de elektron dan cryo-voorbereiding, maar de resolutie is beperkt tot ongeveer 20 Å. Cryo-EM procedures (Figuur 1B) dienst een koolstof ondersteunt. Een dunne film van de monsteroplossing is spanned over de gaten en het EM-raster is ondergedompeld in een cryogen, meestal vloeibaar ethaan, te snel afkoelen onder-150 ° C. Het resultaat is een amorf, verglaasd, 50 tot 100 nm-dikke film van de oplossing in de gaten van de steun. Deze dunne, amorf film doorstaat de hoog vacuüm in de elektronenmicroscoop en, in het ideale geval behoudt biologische structuren in hun oorspronkelijke staat. De procedure kan biologische monsters aan het image worden gemaakt op hoge resolutie. Echter moet het raster van steekproef worden bewaard bij temperaturen hieronder-150 ° C te allen tijde te vermijden ontglazing. Image kan worden gemaakt met behulp van relatief hoge elektron doses als gevolg van de lage temperatuur, maar het contrast en signaal-/ ruisverhouding is toch laag. Dus gemiddeld technieken zijn gebruikt om het contrast te verhogen en, mits de steekproef is beeld vanuit verschillende hoeken, een high-resolution driedimensionale (3D)-kaart kan worden gereconstrueerd. De meest gebruikte en zeer succesvolle methode voor 3D reconstructie vanaf nu is de aanpak van één deeltje. Zie voor een recente review, Cheng op al.18.
Negatieve vlek TEM (NS-EM) is belangrijk voor screening en kwaliteitscontrole, wanneer hoog contrast vereist is of wanneer er slechts een beperkte hoeveelheid monster beschikbaar zijn (adsorptie aan de koolstof-film over het algemeen richt zich het monster). Één deeltje cryo-EM is de gouden standaard methode als high-resolution 3D-reconstructies van de eiwitstructuur voor zijn gericht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Figuur 1: beginselen van TEM raster voorbereiding en vergelijking tussen het klassieke (deelvenster A, B) en een microfluidic benadering (deelvenster C, D). A) klassieke NS-EM raster voorbereiding: over 3 µL van monster zijn afgepipetteerde met de hand op een raster van de EM bedekt met een film van de continue koolstof (hierna een "NS-EM raster' genoemd) (i). Na incubatie gedurende ca. 10 s, filterpapier wordt gebruikt om de vlek weg de overtollige vloeistof uit de kant (ii), waardoor de geadsorbeerde biomoleculen in een dunne water-film. Het eiwit is vervolgens geïncubeerd in een zoutoplossing van heavy metal, bijvoorbeeld, 2% uranyl acetaat, voor 20 s (iii), en opnieuw de vloeistof wordt verwijderd door het bevlekken van de kant met behulp van filtreerpapier (iv). Tot slot wordt het EM-raster overgelaten aan het drogen in de lucht. B) klassieke cryo-EM raster voorbereiding: afgepipetteerde over 3 µL van monster zijn door een hand op een film van een koolstof. Vormen een dunne monster film, wordt de overtollige vloeistof verwijderd door papier-bevlekken gezicht-op uit één of beide zijden (ii). Tot slot is het raster snel ondergedompeld in vloeibare ethaan voor verglazing (iii). C) NS-EM raster voorbereiding met behulp van het cryoWriter-setup: A 5 nL volume is aanzuiging uit de voorraad van de monster met behulp van een microcapillary (i). De microcapillary tip is voor monster conditioning, ondergedompeld in de conditionering oplossing, bijvoorbeeld2% ammoniumacetaat. Ionen en kleine moleculen worden uitgewisseld door diffusie (ii). Merk op dat de afmetingen van de microcapillary ervoor zorgen dat het hele proces diffusie gedreven. Eiwitten hebben veel lagere diffusie-constanten zijn dan zout ionen en24niet aanzienlijk verloren. Tot slot is het monster afgeleverd op de grid en toegestaan om te drogen (iii). D) beginselen van cryo-EM raster preparaat met behulp van de cryoWriter gebaseerde methode: An EM raster bedekt met een film van een koolstof is geplaatst op het oppervlak van een temperatuurgevoelig platform en gehouden door pincet. De temperatuur van het platform wordt beheerd op een offset van de dauwpunt temperatuur van de omgeving van het raster. Het raster wordt verplaatst ten opzichte van de microcapillary met het monster en de microcapillary wordt verlaagd totdat het enkele micrometers boven het raster. Vervolgens zijn een paar nanoliters van monster afgezien van het terwijl de fase wordt verplaatst in een spiraalpatroon; overtollige vocht is opnieuw aanzuiging (i). Na EM raster priming, de microcapillary is ingetrokken en het raster blijft op de temperatuur gecontroleerde platform (hierna genoemd als dauwpunt (DP) fase) voor een korte tijd om een gecontroleerde hoeveelheid monster te verdampen. Voor duik bevriezing, is het raster snel teruggetrokken uit het werkgebied met het pincet (ii), bladerde door 90° in de verticale positie, en ondergedompeld in een bad met cryogen (iii) (hierna 'pick-en-wagen' mechanisme genoemd). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Helaas, het raster voorbereiding methoden voor NS en cryo-EM hebben niet aanzienlijk verbeterd sinds ze werden uitgevonden. Huidige nadelen zijn de hoge monster consumptie (ca. 3 µL van het eiwit van 1 mg/mL) en de grote hoeveelheid (> 99%) monster verloren (Figuur 1A, B). Bovendien, de klassieke methode gebruikt voor te bereiden op rasters cryo-EM is een strenge procedure voor eiwitten: ten eerste, het gaat om een uitgebreide gezicht-op papier-bevlekken stap (Figuur 1B, ii), en ten tweede, het eiwit wordt blootgesteld aan de lucht-water-interface voor een aanzienlijke hoeveelheid tijd21. Hier, een alternatieve methode voor het monster preconditionering, Raster monstervoorbereiding en post-processing (raster drogen of verglazing) voor NS-EM (Figuur 1C) of cryo-EM (Figuur 1D) wordt gepresenteerd. De in-house gebouwde setup, genaamd "cryoWriter", gebruikt verkleinde monster hanteren beginselen van technologie- en microfluidic gecombineerd, voorwaarde en afzien van monster, vermijden papier volledig bevlekken en het bieden van alternatieve methoden voor dunne monsters voor Cryo-EM. Het aanzienlijk vermindert monster consumptie en verbetert gebruiker-controle over de bereiding van de monsters als geheel. Bovendien, de methode maakt het mogelijk nieuwe experimentele toepassingen; zoals de voorbereiding van geïsoleerde biologische componenten van afzonderlijke cellen in een aanpak genaamd "eencellige visuele proteomics"22,23,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

Als gevolg van de recente technologische vooruitgang, wordt cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) snel steeds een standaardmethode voor de structurele analyse van eiwitcomplexen atomaire resolutie. Eiwit isolatie technieken en monster bereidingswijzen voor EM blijven echter een knelpunt. Een relatief klein aantal (100.000 tot een paar miljoen) individuele eiwit deeltjes moet worden beeld voor de hoge-resolutie analyse van eiwitten door het één deeltje EM aanpak, waardoor verkleinde monster behandeling technieken en beginselen van de microfluidic haalbaar.
Een verkleinde, bevlekken-papierloze EM raster voorbereiding methode voor monster pre-conditionering, EM raster priming en nabewerking die alleen nanoliter volumes van monster verbruikt wordt gepresenteerd. De methode maakt gebruik van een doseersysteem met een sub-nanoliter precisie van vloeibare opname van de controle en EM raster priming, een platform waarmee de temperatuur van de raster waardoor het bepalen van de relatieve vochtigheid boven het EM-raster en een pick-en-duik-mechanisme voor het monster verglazing. Voor cryo-EM, een raster van EM in het werkgebied temperatuurgevoelig is geplaatst en het monster wordt in een capillair aanzuiging. De capillaire tip is geplaatst in de nabijheid van het oppervlak van het raster en het raster is geladen met het monster overmaat is opnieuw opgezogen in de microcapillary. Vervolgens is het monster film gestabiliseerd en lichtjes dunner door verdamping van de gecontroleerde water geregeld door de verschuiving van de platform-temperatuur ten opzichte van het dauwpunt. Op een gegeven moment wordt het mechanisme van de pick-en-duik geactiveerd, snel overbrengen van de primer EM raster naar vloeibaar ethaan voor monster verglazing. Als alternatief, monster-conditioning methoden zijn beschikbaar voor te bereiden op monster nanoliter middelgrote volumes negatieve vlek (NS) EM.
De methoden sterk monster verbruik te verminderen en voorkomen van benaderingen van potentieel schadelijke eiwitten, zoals het filtreerpapier bevlekken gebruikt in de conventionele methoden. Voorts staat de minuscule hoeveelheid monster nodig nieuwe experimentele strategieën, zoals snelle monster conditioning, combinatie met eencellige lysis voor "visuele proteomics", of "lossless" voorbereiding van de totale steekproef voor kwantitatieve analyse van complexe monsters.

Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...