Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
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Les auteurs aimeraient remercier l’atelier de la Biozentrum de l’Université de Bâle pour leur soutien, S. A. Müller de discussions critiques et de lire attentivement le manuscrit, A. Fecteau-LeFebvre pour l’assistance technique avec EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann pour protéine membranaire tester des échantillons (tous des C-CINA, Biozentrum, Université de Bâle) et A. Engel, émérite Université Bâle pour ses conversations inspirantes. Les échantillons ont été gracieusement fournis par P. Ringler, m.-a Mahi et T. Schwede (Biozentrum, Université de Bâle), P. Leiman (laboratoire de biologie structurale et biophysique, EPFL) et R. Diaz-Avalos (Structural Biology Center de New York, États-Unis). Le projet a été soutenu par l’Institut suisse de nanosciences (SNI, projet P1401, projet ARGOVIA MiPIS) et le Swiss National Science Foundation (SNF, projet 200021_162521).

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Les auteurs Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg et Thomas Braun déclarent l’intérêt financier concurrent suivant : le concept de cryoWriter fait partie de la demande de brevet PCT / EP2015/065398 et EP16194230.

L’instrument de « cryoWriter » et les protocoles requis pour préparer les grilles échantillon pour NS - et cryo-EM des volumes d’échantillon total nL taille et complètement éviter l’étape de papier-buvard classique sont présentés. Principes de microfluidique et un système de micromécanique sont combinés dans le cryoWriter pour rendre cela possible.
Notre expérience montre que lorsque les méthodes miniaturisés présentées dans ce manuscrit sont utilisés, l’espace de paramètre pour la préparation de l’EM-grille est plus grand que des méthodes classiques et sous un contrôle plus strict utilisateur. Ce qui est important, la reproductibilité accrue atteinte permet de pré-visualiser avec système de tampon échantillon, complété par une protéine test facilement disponibles, pour déterminer les paramètres optimaux avant l’expérience réelle ne soit effectuée. Ceci maintient la consommation de l’échantillon d’intérêt à l’absolu minimum et est fortement recommandée. Les étapes cruciales pour les deux préparation de grille NS - et cryo-EM sont : (i) d’amorçage du système pompe ; pour sup-nanolitres toute distribution de volume, le liquide (eau) doit être dégazée et bubble gratuit. (ii) contrôle précis de la lampe à décharge luminescente ou plasma nettoyage étape ; les caractéristiques de surface de la grille de l’EM sont essentiels pour obtenir des résultats reproductibles. (iii) conditionnement d’échantillon ; le temps requis pour le conditionnement, par exemple, avec NS, dépend le type de tampon, la teneur en sel et la concentration (Figure 3), ainsi que sur la géométrie de la buse de la microcapillaire24. (iv) taux d’évaporation des préparatifs de la NS-EM EM quantitative ; l’effet du café-anneau peut interdire l’analyse quantitative des préparations de NS-EM et doit être supprimée par des taux d’évaporation lente contrôlées par la DP-scène.
Différents aspects des méthodes de préparation de la grille présentée librement combinables permettant l’élaboration de protocoles polyvalents pour des exemples spécifiques. Des exemples typiques seraient l’élimination d’une substance qui empêche les EM à haute résolution, par exemple, glycérol, par une étape de conditionnement avant la préparation de la grille pour cryo-EM ; l’introduction de molécules de médiateur, comme ligands, par conditionnement avant que les grilles sont préparées ; ou l’examen de la seule cellule de lysat de NS - ou cryo-EM (Figure 6).
L’utilisation de la microfluidique et des quantités d’échantillon minimale dans les méthodes présentées supprime complètement le besoin d’étapes papier-buvard. Il s’agit d’un grand avantage, car le papier buvard est un traitement sévère pour les protéines, potentiellement contaminer l’échantillon avec les ions indésirables et intrinsèquement conduisant à la perte massive d’échantillon. En revanche, les effets potentiels de l’interface air-eau du film mince échantillon formé quand les échantillons de cryo-EM sont préparés à la manière classique sont évités pas lorsque le cryoWriter est utilisé. Grilles pour cryo-EM peuvent être préparés avec un temps d’attente inférieur à 0,2 s entre l’exemple d’application et de la vitrification (données non présentées). Cependant, comme protéines voyagent quelques dixièmes de nanomètre en quelques nanosecondes par diffusion, il est encore assez de temps pour eux d’entrer en collision avec l’interface air-eau d’un film d’épaisseur d’échantillon nm 100 plusieurs fois. Cependant, la quantité de protéines s’en tenir à l’interface air-eau peut être significativement réduite par ces lacunes de peu de temps et pourrait empêcher la dénaturation de la protéine ou restreinte d’orientation de la particule. Une autre approche prometteuse qui pourrait protéger les protéines sensibles de l’interface air-eau est de couvrir le film échantillon de tensio-actifs de faible poids moléculaire. Ces composés pourraient être rapidement présentés par une étape de conditionnement dans le cryoWriter avant la préparation de la grille. Le rapport surface-volume élevé des systèmes microfluidiques est une autre limite de le cryoWriter, comme échantillon peut potentiellement être perdu par adsorption non spécifique à la surface microcapillaire et perturber l’analyse quantitative par comptage des particules. Le problème est abordé de deux façons : tout d’abord, l’échantillon ne déplace pas dans le microcapillaire de longues distances. En effet, le volume d’échantillon nanolitres reste à la pointe capillaire tout au long du traitement. En second lieu, la surface à rapport volumétrique est plus réduite en utilisant microcapillaries avec relativement grands diamètres intérieurs, par exemple, 180 µm. Troisièmement, les surfaces de la microcapillaries peuvent être facilement passivés, si nécessaire, par exemple, en les traitant avec glycols d’éthanol polylysine commercialement disponibles (PLL-PEG).
L’analyse à haute résolution des protéines par l’approche d’une seule particule utilisée dans EM exige seulement 100 000 pour quelques images de millions de particules de protéines individuelles. Cela signifie que les techniques microfluidiques peuvent fournir assez complexes de protéine pour l’enquête structurelle. Une méthode immuno-précipitation miniaturisés pour l’isolement rapide de complexes protéiques (environ 1 heure) des montants minimes cellulaire (env. 40 000 cellules) a été développée plus tôt28. Cette méthode est maintenant directement liée à la phase de préparation d’échantillon miniaturisée de la cryoWriter. L’objectif final est de développer un pipeline intégré microfluidiques pour protéine ultra-rapide d’isolement et cryo-EM grille préparation qui nécessite moins de deux heures en tout. En outre, comme le montre la Figure 6, la quantité infime et le volume du matériel nécessaire pour la préparation des échantillons et la climatisation presque sans perte et la procédure de préparation de grille réalisée à l’aide de la cryoWriter, permettent d’étudier la protéine complexes de cellules individuelles. Ensemble, la méthode d’immuno-précipitation miniaturisés et le cryoWriter jeter les fondements d’une nouvelle méthode de protéomique, appelée « cellule unique visual protéomique », comme nous l’a récemment démontré pour le choc thermique expériences24. Les algorithmes d’analyse de données axées sur l’analyse d’images « protéomique visuelle » sont actuellement à l’essai.

Matériel et logiciels pour l’analyse structurale des complexes de protéine par microscopie électronique à transmission (TEM) a massivement avancé au cours de ces dernières années. Les améliorations apportées a ouvert la voie à une « révolution de la résolution »1,2 et fondamentalement changé recherche structurale. La révolution a commencé avec l’avènement de cryo-electron microscopy (cryo-EM)3,4, qui permet la préparation d’échantillons biologiques sous proche des conditions physiologiques tout en diminuant la sensibilité de la radiation et la prévention évaporation d’échantillon dans le vide du microscope électronique à transmission5. Dans les années suivantes, progrès technologique a graduellement augmenté la résolution réalisable. Parmi ces innovations ont été l’application de canons de l’émission de champ6,7et, plus récemment, amélioration des algorithmes d’analyse de données, tels que les méthodes de maximum de vraisemblance8,9. Direct électronique détecteur caméras10,11,12,13, imagerie en mode film et l’accompagnement logiciel développements14,15, 16 , 17, fourni la percée finale requise pour atteindre la résolution atomique pour échantillons biologiques par analyse de particules uniques (pour une revue, voir Cheng, Grigorieff, et al. 18). l’importance de la cryo-EM a récemment été reconnu par l’attribution du prix Nobel de chimie à trois des pionniers.
Pour un échantillon biologique par TEM de l’image, la méthode utilisée pour charger la grille EM avec l’échantillon (par la suite dénommé « préparation de la grille ») doit s’assurer que la couche résultante de l’échantillon (i) est assez mince (< 100 nm) pour éviter les bruits de vastes d’inélastiques ou multiplier dispersés électrons, (ii) résiste au vide poussé du microscope électronique, et (iii) protège les biomolécules des radiolésions. Deux méthodes principales sont utilisées pour remplir ces gratifications : colorant négatif(NS)19,20 procédures (Figure 1A) adsorbent l’échantillon à un film de carbone mince, incorporer les biomolécules dans amorphe métaux lourds, puis permettre à l’Assemblée sécher à l’air. C’est simple et rapide, et les grilles de EM chargés (par la suite dénommés « grilles d’échantillon ») sont faciles à stocker et peuvent être maintenus pendant de longues périodes de temps (en général années). En TEM, les préparations présentent un contraste élevé en raison de la NS et tolèrent des doses plus élevées d’électrons que cryo-préparations, mais la résolution est limitée à environ 20 procédures Å. Cryo-EM (Figure 1B) emploient holey carbone prend en charge. Une couche mince de la solution échantillon est enjambée à travers les trous et la grille de l’EM est plongée dans un cryogène, éthane habituellement liquéfié, pour la refroidir rapidement au-dessous de-150 ° C. Le résultat est un amorphe, vitrifiée, 50 à 100 nm d’épaisseur film de la solution dans les trous de la prise en charge. Ce film mince, amorphe résiste le vide poussé au microscope électronique et, dans le cas idéal, préserve les structures biologiques dans leur état natif. La procédure permet d’échantillons biologiques à être photographiée à haute résolution. Cependant, la grille de l’échantillon doit être conservée à température ci-dessous-150 ° C en permanence pour éviter les devitrification. Il peut être copié à l’aide de doses relativement élevées d’électrons en raison de la basse température, mais le contraste et le rapport signal-bruit est néanmoins faible. Par conséquent, moyenne techniques sont employées pour augmenter le contraste et, pourvu que l’échantillon est photographié sous différents angles, Tèlèchargez la carte en trois dimensions (3D) peut être reconstruite. Le plus couramment utilisé et une méthode très réussie pour la reconstruction 3D à partir de maintenant est l’approche d’une seule particule. Pour une revue récente, voir Cheng al.18.
Colorant négatif TEM (NS-EM) est important pour le dépistage et le contrôle de la qualité, quand le contraste élevé est nécessaire ou lorsqu’il existe seulement une quantité limitée de l’échantillon (adsorption pour le film de carbone concentre généralement l’échantillon). Une seule particule cryo-EM est la méthode de l’étalon-or si les reconstructions 3D haute résolution de la structure de la protéine sont visées pour.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Figure 1: préparation de grille de principes de TEM et la comparaison entre le classique (panneau A, B) et une approche de microfluidique (panneau C, D). A) préparation de grille classique NS-EM : environ 3 µL de l’échantillon sont reversé à la main sur une grille de EM recouverte d’un film de carbone continue (dénommé par la suite une « grille de NS-EM ») (i). Après incubation pendant env. 10 s, papier filtre est utilisé pour sécher à l’excès de liquide du côté (ii), laissant les molécules adsorbées dans un film mince de l’eau. Par la suite, la protéine est incubée dans une solution de sel de métaux lourds, par exemple, 2 % d’acétate d’uranyle, pendant 20 s (iii) et nouveau le liquide est supprimé en tamponnant sur le côté à l’aide de papier filtre (iv). Enfin, l’EM-grille on laisse pour sécher à l’air. B) préparation de grille classique cryo-EM : environ 3 µL de l’échantillon sont distribués par un coup de main sur un film de carbone trouée. Pour former un film mince échantillon, le liquide excédentaire est enlevé par le papier-buvard visage-sur d’une ou deux faces (ii). Enfin, la grille est rapidement plongée dans éthane liquide pour la vitrification (iii). C) préparation de grille de NS-EM en utilisant la configuration de cryoWriter : volume A 5 nL est aspiré de la crosse de l’échantillon à l’aide d’un microcapillaire (i). Pour exemple de conditionnement, la pointe microcapillaire est immergée dans la solution de climatisation, par exemple, 2 % d’acétate d’ammonium. Ions et petites molécules sont échangés par diffusion (ii). Notez que les dimensions de la microcapillaire veille à ce que l’ensemble du processus est piloté par diffusion. Les protéines sont les constantes de diffusion beaucoup plus faible que les ions de sels et ne disparaissent pas significativement24. Enfin, l’échantillon est distribué sur la grille et laisser sécher (iii). D) principes de préparation de grille de cryo-EM à l’aide de la méthode axée sur les cryoWriter : EM An grille recouverte d’un film de carbone holey est placé sur la surface d’une plateforme à température contrôlée et qui s’est tenue par la pince à épiler. La température de la plate-forme est contrôlée à un décalage par rapport à la température de point de rosée de l’environnement de la grille. La grille est déplacée par rapport à la microcapillaire contenant l’échantillon et le microcapillaire s’abaisse jusqu'à ce qu’il est de quelques micromètres au-dessus de la grille. Par la suite, quelques microseringues de l’échantillon sont dispensés d’elle, tandis que la scène est déplacée dans un motif en spirale ; le liquide en excès est ré-aspiré (i). Après la grille EM d’amorçage, le microcapillaire est retiré et la grille reste sur la plateforme contrôlées de température (par la suite appelée stade de point de rosée (DP)) pendant une courte période afin de permettre une quantité contrôlée de l’échantillon de s’évaporer. Pour plongeon de congélation, la grille est rapidement retirée de la scène à l’aide de la pince à épiler (ii), renversée par 90° en position verticale et plongée dans un bain de cryogène (iii) (par la suite dénommé « pick-et-plongeon » mécanisme). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Malheureusement, les méthodes de préparation de grille utilisées pour NS et cryo-EM n’ont pas significativement amélioré depuis qu’ils ont été inventés. Les inconvénients actuels sont la consommation élevée d’échantillon (env. 3 µL de protéine de 1 mg/mL) et la grande quantité (> 99 %) de l’échantillon (Figure 1A, B) a perdu. En outre, la méthode classique utilisée pour préparer les grilles pour cryo-EM est une procédure dure pour les protéines : tout d’abord, il s’agit d’une vaste visage-sur papier-buvard étape (Figure 1B, ii), et, deuxièmement, la protéine est exposée à l’interface air-eau pour une quantité importante de temps21. Ici, une méthode alternative pour échantillon pré conditionnement, préparation des échantillons grille et post-traitement (grille de séchage ou vitrification) pour NS-EM (Figure 1C) ou cryo-EM (Figure 1D) est présenté. Le programme d’installation intégré interne, appelé « cryoWriter », utilise miniaturisé échantillon manutention principes technologiques et microfluidique pour aspirer, condition et de distribuer des échantillons, en évitant de papier buvard complètement et en fournissant des méthodes alternatives aux échantillons minces pour Cryo-EM. Il a considérablement réduit la consommation d’échantillon et améliore le contrôle utilisateur au cours de la préparation de l’échantillon dans son ensemble. En outre, la méthode permet de nouvelles applications expérimentales ; comme la préparation des composants biologiques isolés des cellules individuelles dans une approche appelée « cellule unique visual protéomique »22,23,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

En raison des progrès technologiques récents, cryo microscopie électronique (cryo-EM) devient rapidement une méthode standard pour l’analyse structurale des complexes de protéine à la résolution atomique. Cependant, techniques d’isolation de protéine et les méthodes de préparation d’échantillon pour EM restent un goulot d’étranglement. Un nombre relativement faible (100 000 à quelques millions) des particules de protéines individuelles doivent être photographié pour l’analyse à haute résolution des protéines par la seule particule approche EM, rendant l’échantillon miniaturisé manipulation techniques et principes microfluidiques faisable.
Miniaturisés, papier-buvard-free EM grille PROCEDE de preparation de pré conditionnement d’échantillon, de EM grille d’amorçage et de post-traitement qui ne consomme que nanolitre-volumes d’échantillon est présenté. La méthode utilise un système de distribution avec une précision sub-nanolitres pour absorption liquide contrôle et amorçage grille EM, une plate-forme pour contrôler la température de la grille ainsi déterminer l’humidité relative au-dessus de la grille de l’EM et un pick-et-plongée-mécanisme d’échantillon vitrification. Pour cryo-EM, une grille d’EM est placée sur la scène à température contrôlée et l’échantillon est aspiré dans un tube capillaire. La pointe capillaire est placée à proximité de la surface de la grille, la grille est chargée avec l’échantillon et excès est ré-aspiré dans le microcapillaire. Par la suite, le film de l’échantillon est stabilisé et légèrement éclairci par évaporation de l’eau contrôlée réglementée par le décalage de la température de la plate-forme par rapport au point de rosée. À un moment donné, le mécanisme de choix-et-plongement est déclenché, transférer rapidement la grille EM amorcée en éthane liquide pour la vitrification de l’échantillon. Alternativement, les méthodes de conditionnement d’échantillon sont disponibles pour préparer le volume des échantillons de taille nanolitres pour une coloration négative (NS) EM.
Les méthodologies de considérablement réduisent la consommation de l’échantillon et éviter les approches potentiellement nuisibles aux protéines, telles que le filtre papier buvard utilisées dans les méthodes conventionnelles. En outre, la minuscule quantité d’échantillon nécessaire permet de nouvelles stratégies expérimentales, telles que rapide exemple conditionné, combinaison avec lyse monocellulaires pour « protéomique visuel », ou « sans perte » préparation de l’échantillon total pour l’analyse quantitative des échantillons complexes.

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Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Méthodes pour la préparation du volume des échantillons de taille nanolitres pour microscopie électronique à transmission et un instrument est présenté. Aucune étape de papier-buvard est requise, afin d’éviter les conséquences négatives que cela peut avoir pour les protéines, considérablement réduisant la perte de l’échantillon et permettant l’analyse de lysat pour la protéomique visuel unique cellule.

Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

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