Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

המחברים רוצה להודות הסדנה לפיתוח Biozentrum של באזל האוניברסיטה על תמיכתם, מולר א ס עבור דיונים קריטיים, לקרוא היטב את כתב היד, א Fecteau-לפבוורה לקבלת סיוע טכני עם EM, ריקרדו Adaixo, פרנק להמן עבור חלבון ממברנלי לבחון דגימות (כל C-CINA, Biozentrum, אוניברסיטת בזל) ו א אנגל, אמריטוס באוניברסיטת באזל לשיחות שלו מעוררת השראה. הבדיקה דוגמאות בחביבות שסופקו על-ידי עמ' Ringler, מא Mahi, ט Schwede (Biozentrum, אוניברסיטת בזל), פ ליימן (המעבדה של ביולוגיה מבנית, ביופיסיקה, EPFL), ר' דיאז-Avalos (מרכז לביולוגיה מבנית בניו-יורק, ארה ב). הפרויקט נתמך על ידי המכון הננו שוויצרי (סני, פרוייקט P1401, ARGOVIA פרוייקט MiPIS) ושוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNF, project 200021_162521).

<ol>
	<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry:+The+resolution+revolution.">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>Bai, X. -. c., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology.">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li><li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions.">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, 89-102 (1983).</li><li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy.">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li><li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+gun+using+a+field+emission+source.">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li><li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expected+contribution+of+the+field-emission+gun+to+high-resolution+transmission+electron+microscopy.">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li><li>Milazzo, A. -. C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -. H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy.">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li><li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy.">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li><li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -. y., Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors.">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li><li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Cryo-EM+movie+data.">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy.">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy.">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+can+cryo-EM+become.">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li><li>Engel, A., Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+.">in .</a> Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. 96, 417-431 (2010).</li><li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., M&#252;ller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+&#181;-fluidics+to+electron+microscopy.">Connecting &#181;-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy.">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li><li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy.">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li><li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., M&#252;ller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBEB:+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements.">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).</li><li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+interactome:+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy.">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li></ol>

המחברים סטפן א ארנולד, הנינג סטולברג, תומאס בראון להכריז את האינטרסים הפיננסיים מתחרים הבאים: הרעיון cryoWriter הוא חלק פטנט PCT / EP2015/065398 ו- EP16194230.

הכלי 'cryoWriter' ואת הפרוטוקולים נדרש להכין רשתות דוגמת עבור NS - ו הקפאה-EM מאמצעי אחסון המדגם nL בגודל ולהימנע לחלוטין את הצעד נייר סופג קלאסית מוצגים. עקרונות Microfluidic ומערכת micromechanical משולבים ב cryoWriter כדי שזה אפשרי.
הניסיון שלנו מראה כי כאשר משתמשים בשיטות ולמחקר שהוצגו בכתב היד, המרחב פרמטר להכנה EM-רשת גדולה יותר עבור שיטות קלאסיות, ותחת בקרת משתמש הדוק יותר. חשוב, הפארמצבטית מוגברת מושגת מאפשר למיין מראש עם מערכת מאגר לדוגמה, השלים עם חלבון הבדיקה זמינים, כדי לקבוע את הפרמטרים אופטימלי לפני הניסוי בפועל מתבצע. זה שומר הצריכה של המדגם של ריבית המינימום המוחלט, מומלץ בחום. צעדים קריטיים להכנה רשת שני NS - ו הקפאה-EM: (i) הטרמה של מערכת המשאבה; sub-nanoliter נפח dispensing, הנוזל מערכת (מים) חייב להיות degassed, בועה ללא תשלום. (ii) שליטה מדויקת של זוהר פריקה או פלזמה ניקוי שלב; מאפייני הרשת EM משטח מכריעים לתוצאות לשחזור. (iii) דוגמת מיזוג; הזמן הנדרש עבור מיזוג, למשל, עם NS, תלוי סוג המאגר, תוכן מלח וריכוז (איור 3), כמו גם על הצורה הגאומטרית זרבובית של microcapillary24. (iv) אידוי המחירים עבור NS-EM ההכנות EM כמותיים; האפקט קפה-טבעת יכול לאסור ניתוח כמותי של ההכנות NS-EM, בטח להיחסם על ידי אידוי איטי תעריפים בשליטת DP-הבמה.
היבטים שונים של שיטות הכנה רשת שהוצגו יכול להיות בחופשיות משולב המאפשר הפיתוח של פרוטוקולים רב-תכליתי עבור דוגמאות ספציפיות. דוגמאות טיפוסיות יהיה הסרת חומר המונע ברזולוציה גבוהה אם, לדוגמה, גליצרול, על ידי צעד מיזוג לפני הרשת לקראת הקפאה-EM; המבוא של מולקולות המתווך, כגון ליגנדים, על-ידי מיזוג לפני הרשתות מוכנות; או הבחינה של תא בודד lysate על ידי NS - או הקפאה-EM (איור 6).
השימוש מיקרופלואידיקה וכמויות מדגם מינימלי בשיטות הציג מסיר לחלוטין את הצורך צעדים נייר סופג. זה יתרון גדול, כי נייר סופג הוא טיפול אכזרי חלבונים, פוטנציאל זיהום הדגימה עם יונים לא רצויים, מטבעו מוביל לירידה מדגם מסיבית. מצד שני, אפקטים פוטנציאל הנגרמת על ידי ממשק מים אוויר של הסרט דק מדגם שנוצר כאשר דגימות הקפאה-EM הינן מוכנות באופן קלאסי נחסכים לא כאשר cryoWriter. רשתות מתאים הקפאה-EM ניתן להכין עם זמן המתנה פחות מ 0.2 s בין יישום מדגם ויטריפיקציה (נתונים לא מוצג). עם זאת, חלבונים נוסעים כמה עשיריות ננומטר ב מבצע איתחול באמצעות דיפוזיה, יש עדיין מספיק זמן בשבילם להתנגש עם ממשק מים אוויר של סרט עבה מדגם 100 ננומטר מספר פעמים. עם זאת, כמות חלבונים נדבקות הממשק מים אוויר יכול להיות מופחת באופן משמעותי על ידי פערים אלה זמן קצר, עשויה למנוע דנטורציה של חלבונים או מוגבלת כיוון חלקיקים. גישה מבטיחה אחרת עשויה להגן על חלבונים רגיש מממשק מים אוויר היא לכסות את הסרט מדגם על ידי חומרים surface-active נמוך משקל מולקולרי. תרכובות אלו יכול להיות מוצג במהירות על ידי צעד מיזוג cryoWriter לפני ההכנה רשת. היחס השטח לבנפח גבוה של מערכות microfluidic היא מגבלה נוספת של cryoWriter, כמו לדוגמה יכול פוטנציאלית להיות איבד ידי ספיחה לא ספציפי השטח microcapillary ולנער ניתוח כמותי על ידי ספירת חלקיקים. שהבעיה תטופל בשתי דרכים: ראשית, המדגם לא לנסוע מרחקים ארוכים בתוך microcapillary. אכן, האחסון מדגם nanoliter נשאר בקצה צינור קפילר במהלך העיבוד. שנית, פני השטח יחס נפח תקטן עוד יותר באמצעות microcapillaries עם קטרים הפנימי גדול יחסית, למשל, 180 מיקרומטר. שלישית, המשטחים של microcapillaries יכול להיות בקלות passivated במידת הצורך, למשל, אם תתייחס אליהם עם polylysine זמינים מסחרית אתנול glycols (PLL-PEG).
ניתוח ברזולוציה גבוהה של חלבונים על ידי חלקיק יחיד לגישת ב EM דורש רק 100,000 לתמונות מיליון כמה חלקיקי חלבונים בודדים. משמעות הדבר היא כי טכניקות microfluidic יכול לספק מתחמי מספיק חלבון בשביל החקירה מבנית. שיטה חיסונית מיניאטורי-משקעים הבידוד מהירה של חלבון מתחמי (כשעה) מן התא מינימלי כמויות (כ – 40,000 תאים) פותחה קודמות28. שיטה זו עכשיו תקושר ישירות לשלב הכנת המדגם ולמחקר של cryoWriter. המטרה הסופית היא לפתח של צינור microfluidic משולב להכנה חלבון אולטרה מהיר בידוד, הקפאה-EM רשת שדורש פחות משעתיים בכל. יתר על כן, כפי שמתואר באיור 6לכמות מזערית של אמצעי אחסון של חומר לצורך הכנת הדוגמא ואת מיזוג כמעט ללא אובדן נתונים הליך הכנת רשת מושגת באמצעות את cryoWriter, מאפשרים ללמוד החלבון קומפלקסים של תאים בודדים. יחד, השיטה חיסונית מיניאטורי-משקעים, את cryoWriter להניח את היסודות של שיטה פרוטאומיקס חדשה הנקראת "תא בודד פרוטאומיקס חזותי", כפי לאחרונה להדגים עבור ניסויים חום-הלם24. כיום נבדקות באלגוריתמים לניתוח נתונים המיועדים לניתוח של תמונות "פרוטאומיקס חזותי".

חומרה, תוכנה לניתוח המבני של חלבון מתחמי מאת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מאסיבית כולל מתקדמת במהלך השנים האחרונות. השיפורים סלל את הדרך "מהפיכת הרזולוציה"1,2 , נוגש המחקר המבני. המהפכה החלה עם כניסתו של הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM)3,4, המאפשר ההכנה של דגימות ביולוגיות. תחת קרוב בתנאים פיזיולוגיים תוך הפחתת רגישות לקרינה ומניעת לדוגמה אידוי אבק גבוהה של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים5. בשנים הבאות, בהדרגה ההתקדמות הטכנולוגית מצטבר הרזולוציה השגה. בין חידושים אלה היו היישום של פליטת שדה רובים6,7, ומשופר, לאחרונה, אלגוריתמים של ניתוח נתונים, כגון נראות מקסימלית שיטות8,9. אלקטרון ישירה גלאי מצלמות10,11,12,13, הסרט במצב הדמיה ומן הנלווה תוכנה התפתחויות14,15, 16 , 17, סיפק את פריצת הדרך האחרונה הדרוש להשגת ברזולוציה אטומית עבור דגימות ביולוגיות על ידי חלקיק יחיד ןועברל (ראו סקירה צ'אנג, Grigorieff, et al. 18)-החשיבות של הקפאה-EM הוכרה לאחרונה על ידי בפרס הנובל לכימיה של החלוצים שלושה.
כדי דמות דגימה ביולוגית על ידי TEM, השיטה שבה נעשה שימוש כדי לטעון את הרשת EM עם דגימת (המכונה לאחר מכן "רשת הכנה") עליך לוודא כי השכבה מדגם וכתוצאה מכך (i) הוא מספיק דק (< 100 ננומטר) כדי למנוע רעש מקיף מאת ששינוי או להכפיל מפוזרים אלקטרונים, (ii) עומד על ואקום גבוה של מיקרוסקופ אלקטרונים, ומגן (iii) של מולקולות מפני נזקי קרינה. שתי שיטות עיקריות משמשות כדי למלא את perquisites האלה: כתם שלילי(NS)19,20 הליכים (איור 1א') לספוח את הדגימה כדי סרט דק פחמן, להטביע את מולקולות במטאל אמורפי ולאחר מכן לאפשר את מכלול להתייבש באוויר. זו פשוטה ומהירה, הרשתות EM טעון (המכונה לאחר מכן "רשתות דוגמת") הם קל לאחסן, יכול להישמר לתקופה ממושכת של זמן (בדרך כלל שנים). TEM, ההכנות התערוכה חדות גבוהה עקב המחלקה ולא לסבול מינונים גבוהים יותר אלקטרונים מאשר הקפאה-הכנות, אבל הפתרון הוא מוגבל לשגרות Å. הקפאה-EM כ-20 מעסיקים (איור 1B) פחמן חור תומך. בשכבה דקיקה של הפתרון מדגם זה לפרוס על פני החורים ואת הרשת EM הוא צלל לתוך cryogen, אתאן בדרך כלל נוזלי, במהירות לצנן את זה מתחת-150 מעלות צלזיוס. התוצאה היא אמורפי, vitrified, 50 ל- 100 ננומטר בעובי הסרט של הפתרון החורים תמיכה. הסרט דק, אמורפי עומד על ואקום גבוה במיקרוסקופ אלקטרונים ושומר, במקרה האידיאלי, מבנים ביולוגיים במצבם המקורי. ההליך מאפשר דגימות ביולוגיות ליצירת תמונה ברזולוציה. עם זאת, הרשת מדגם חייב להישמר בטמפרטורות מתחת-150 º C בכל עת כדי להימנע devitrification. זה יכול השיקוף באמצעות מינונים גבוהים יחסית אלקטרונים בשל הטמפרטורה הנמוכה, אבל הניגוד, יחס אות לרעש אף על פי כן הוא נמוך. לכן, שיטות חישוב ממוצע רגיל הם מועסקים כדי להגדיל את החדות, בתנאי המדגם הוא עם תמונה מזוויות שונות, מפת תלת מימדי (3D) ברזולוציה גבוהה ניתן יורכבו. הנפוץ ביותר, שיטת מוצלח ביותר עבור שחזור תלת-ממד מעתה הגישה חלקיק יחיד. לסקירה האחרונה, ראה נג ב al.18.
כתם שלילי TEM (NS-EM) הוא חשוב עבור הקרנה, בקרת איכות, כאשר חדות גבוהה נדרשת או כאשר רק כמות מוגבלת של מדגם זמינים (ספיחה לסרט פחמן מתרכז בדרך כלל המדגם). חלקיק יחיד הקפאה-EM היא השיטה בתקן זהב אם שחזורים תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של חלבון מבנה נועדו עבור.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> איור 1: השוואה בין קלאסי (לוח A, B) בגישה microfluidic (לוח C, D) והכנה של רשת עקרונות של TEM. A) קלאסית NS-EM רשת ההכנה: 3 על µL מדגם pipetted בעבודת יד על גבי רשת EM מכוסה סרט פחמן רציפה (המכונה לאחר מכן 'רשת NS-EM') (i). לאחר דגירה במשך כ 10 s, נייר סינון משמש כדי למחוק משם את הנוזל עודף מהצד (ii), עוזב את מולקולות הספוחה בסרט מים דק. לאחר מכן, החלבון מודגרת תמיסת מלח מתכות כבדות, למשל, אצטט uranyl 2%, עבור 20 s (iii), ושוב הנוזל יוסר על ידי סופג מן הצד באמצעות נייר סינון (iv). לבסוף, EM-הרשת נותר להתייבש באוויר. B) הקפאה קלאסית-EM רשת ההכנה: 3 על µL מדגם הן pipetted על ידי יד על גבי סרט פחמן חור. כדי ליצור סרט דק לדוגמה, הנוזל העודף יוסר על ידי נייר סופג הפנים-של אחד או שני הצדדים (ii). בסופו של דבר, הרשת הוא צלל במהירות לתוך נוזלי אתאן עבור ויטריפיקציה (iii). C) NS-EM רשת הכנה באמצעות הגדרת cryoWriter: כרך א' 5 nL הוא aspirated מן המלאי מדגם באמצעות של microcapillary (i). עבור מדגם מיזוג, הטיפ microcapillary הוא שקוע בתוך מיזוג תמיסת, למשל, 2% אמוניום אצטט. יונים ומולקולות קטנות מוחלפים על ידי דיפוזיה (ii). שימו לב כי הממדים של microcapillary להבטיח כי התהליך כולו הוא דיפוזיה מונע. חלבונים יש הרבה קבועים דיפוזיה נמוך יותר מאשר יונים מלח, לא באופן משמעותי אבודים24. לבסוף, המדגם ויתרו על גבי הרשת, להתייבש (iii). D) עקרונות הכנת רשת הקפאה-EM בשיטה מבוססת-cryoWriter: EM רשת מכוסה סרט פחמן חור הוא להציב על פני השטח של פלטפורמה מבוקרי טמפרטורה, מוחזק על ידי פינצטה. הטמפרטורה של פלטפורמת נשלטת בהיסט מ הטמפרטורה נקודת הטל של סביבת רשת. הרשת מועברת באופן יחסי microcapillary המכיל את הדגימה, microcapillary היא יורדת עד כמה מיקרומטר מעל הרשת. כתוצאה מכך, כמה nanoliters מדגם הם ויתרו ממנו בזמן השלב מועבר בדפוס ספירלה; עודף נוזלים היא aspirated מחדש (i). לאחר רשת EM הטרמה, microcapillary נסוגה, ה-grid נשאר בפלטפורמה טמפרטורה מבוקרת (לאחר מכן כאל נקודת הטל (DP) שלב) לזמן קצר לאפשר כמות מבוקרת של הדגימה כדי להתאדות. עבור מים עמוקים קפוא, הרשת במהירות מסוגר החל משלב באמצעות את הפינצטה (ii), התהפך 90 ° לתוך המיקום האנכי, צלל לתוך אמבט cryogen (iii) (המכונה לאחר מכן מנגנון 'פיק-ומים עמוקים'). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
למרבה הצער, שיטות הכנה הרשת המשמשים NS הקפאה-EM לא השתפרו באופן משמעותי מאז המציאו. החסרונות הנוכחי הם הצריכה דגימה גבוהים (כ – 3 µL של חלבון 1 מ"ג/מ"ל) ואיבד הסכום גדול (> 99%) מדגם (איור 1A, B). יתר על כן, שיטת קלאסית המשמשת כדי להתכונן רשתות הקפאה-EM הוא הליך קשה חלבונים: ראשית, זה כרוך נרחב עם הפנים נייר סופג צעד (איור 1B, ii), שנית, החלבון נחשף לממשק מים אוויר עבור כמות משמעותית של זמן21. . הנה, שיטה חלופית עבור מדגם מראש מיזוג, הכנת רשת הדוגמא, עיבוד דפוס (רשת ייבוש או ויטריפיקציה) NS-EM (איור 1C) או הקפאה-EM (איור 1D) מוצג. הגדרת שנבנה ללא צורך במיקור חוץ, שנקרא "cryoWriter", משתמש ולמחקר הדגימה טיפול עקרונות וטכנולוגיה microfluidic מחוק לגמרי, מצב של לוותר על הדגימה, הימנעות נייר סופג לחלוטין ומספקת שיטות אלטרנטיביות למניעת הדוגמאות דק עבור הקפאה-EM. זה משמעותי מפחית את צריכת מדגם ומשפר את המשתמש-שליטה על הכנת הדוגמא בכללותה. יתר על כן, שיטת מאפשרת יישומים חדשניים ניסיוני; כגון הכנת מבודדים מרכיבים ביולוגיים של תאים בודדים בגישה נקרא "תא בודד פרוטאומיקס חזותי"22,23,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

עקב ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה, הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM) הופך במהירות שיטה סטנדרטית לניתוח המבני של חלבון מתחמי ברזולוציה אטומית. עם זאת, חלבון בידוד טכניקות ושיטות הכנה לדוגמה עבור EM נשארים צוואר בקבוק. מספר קטן יחסית (100,000 כמה מיליונים) של חלקיקים בודדים חלבון צריך לדימות לניתוח ברזולוציה גבוהה של חלבונים על ידי חלקיק הנע הגישה EM, ביצוע דגימת ולמחקר בטיפול טכניקות ועקרונות microfluidic ריאלי.
מיניאטורי, נייר סופג-ללא EM רשת הכנה שיטת מיזוג מראש לדוגמה, EM רשת לקרקע, לאחר העיבוד שצורכת רק nanoliter-כרכים של מדגם מוצג. השיטה משתמשת מערכת שחולק בדייקנות sub-nanoliter ספיגת נוזלים שליטה של EM רשת לקרקע, פלטפורמה לשלוט בטמפרטורה הרשת ובכך לקבוע את הלחות היחסית מעל הרשת EM, פיק--מים עמוקים-מנגנון למדגם ויטריפיקציה. הקפאה-EM, רשת EM מושם על הבמה מבוקרי טמפרטורה, המדגם הוא aspirated לתוך נים. הטיפ נימי ממוקם בסמיכות אל פני השטח רשת, הרשת היא עמוסה המדגם, עודף היא aspirated מחדש לתוך microcapillary. לאחר מכן, הסרט מדגם התייצב, מדולל במעט מים מבוקרת אידוי מוסדר על ידי ההיסט של הטמפרטורה פלטפורמה ביחס לנקודת הטל. בכל רגע נתון יופעל מנגנון פיק-ומים עמוקים, במהירות העברת הרשת EM להתקפת לתוך נוזלי אתאן עבור מדגם ויטריפיקציה. לחלופין, לדוגמה-מיזוג שיטות זמינות להכשיר אחסון מדגם בגודל nanoliter כתם שלילי (NS) EM.
למתודולוגיות מאוד לצמצם את צריכת מדגם ולהימנע גישות מזיקים חלבונים, כגון מסנן נייר סופג המשמש בשיטות המקובלות. יתר על כן, כמות הדגימה הדרושה זעיר מאפשר אסטרטגיות ניסיוני חדשניים, כגון מהיר דוגמת מיזוג, בשילוב עם פירוק תא בודד עבור "פרוטאומיקס חזותי", או המדגם "אובדן", לקראת ניתוח כמותי של דוגמאות מורכבות.

Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

מכשיר ושיטות ההכנה של אמצעי אחסון מדגם בגודל nanoliter במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מוצג. אין מדרגות נייר סופג נדרשים, וכך להימנע ההשלכות מזיקה שיכולה להיות חלבונים, הפחתת הדגימה אובדן ולאפשר הניתוח של תא בודד lysate עבור פרוטאומיקס חזותי באופן משמעותי.

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...