Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
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Gli autori vorrei ringraziare l'officina del Biozentrum dell'università Basilea per il loro sostegno, S. A. Müller per discussioni critiche e leggendo attentamente il manoscritto, A. fore-LeFebvre per assistenza tecnica con EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann per proteina della membrana testare campioni (tutti dal C-CINA, Biozentrum, Università di Basilea) e r. Engel, emerito università Basilea per le sue conversazioni stimolanti. Campioni di prova sono state gentilmente concesse da P. Ringler, M.-A. Mahi e T. Schwede (Biozentrum, Università di Basilea), p. Leiman (laboratorio di biologia strutturale e biofisica, EPFL) e R. Diaz-Avalos (centro di biologia strutturale di New York, USA). Il progetto è stato sostenuto da Swiss Nanoscience Institute (SNI, progetto P1401, progetto ARGOVIA MiPIS) e la Swiss National Science Foundation (SNF, progetto 200021_162521).

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Gli autori Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg e Thomas Braun dichiarano gli interessi finanziari concorrenti seguenti: il concetto di cryoWriter è parte della domanda di brevetto PCT / EP2015/065398 ed EP16194230.

Lo strumento di 'cryoWriter' e i protocolli richiesti per preparare griglie campione per NS - e cryo-EM da volumi di campione totale nL dimensioni e completamente evitare il passaggio di carta-blotting classico sono presentati. Principi di microfluidica e un sistema di micromeccanica sono combinati in cryoWriter per rendere questo possibile.
La nostra esperienza dimostra che quando vengono utilizzati i metodi miniaturizzati presentati in questo manoscritto, lo spazio di parametro per la preparazione di EM-griglia è maggiore per i metodi classici e sotto stretto controllo di utente. D'importanza, la maggiore riproducibilità raggiunta permette di pre-schermo con sistema tampone del campione, completata con una proteina di test prontamente disponibile, per determinare i parametri ottimali, prima di eseguita l'esperimento vero e proprio. Questo mantiene il consumo del campione di interesse all'assoluto minimo ed è altamente raccomandato. Fasi critiche per entrambi preparazione griglia NS - e cryo-EM sono: (i) Priming del sistema pompa; per l'erogazione del volume sub-nanolitro, il liquido (acqua) deve essere degassato e bolla libero. (ii) preciso controllo dell'effluvio o al plasma pulizia passo; le caratteristiche della superficie della griglia EM sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. (iii) condizionata campione; il tempo richiesto per il condizionamento, per esempio, con NS, dipende dal tipo di buffer, il contenuto di sale e la concentrazione (Figura 3), nonché la geometria dell'ugello del microcapillary24. (iv) tassi di evaporazione per le preparazioni di NS-EM EM quantitativa; l'effetto di anello di caffè può vietare l'analisi quantitativa delle preparazioni di NS-EM e dovrà essere soppresse dai tassi lenta evaporazione controllati dalla DP-fase.
Diversi aspetti dei metodi di preparazione griglia presentati possono essere combinati liberamente permettendo lo sviluppo di protocolli versatile per gli esempi specifici. Esempi tipici sono la rimozione di una sostanza che impedisce EM ad alta risoluzione, ad esempio, glicerolo, da una fase di condizionamento prima della preparazione di griglia per cryo-EM; l'introduzione di molecole di mediatore, come ligandi, di condizionamento prima le griglie sono preparate; o l'esame della singola cella lysata di NS - o cryo-EM (Figura 6).
L'uso della microfluidica e quantità minime nei metodi presentati rimuove completamente la necessità di passaggi carta-blotting. Questo è un grande vantaggio, perché carta assorbente è un duro trattamento per proteine, potenzialmente contaminare il campione con ioni indesiderati e intrinsecamente portando alla perdita massiccia di campione. D'altra parte, gli effetti potenzialmente causati dall'interfaccia aria-acqua del film campione sottile formato quando cryo-EM i campioni sono preparati nel modo classico non sono evitati quando viene utilizzato il cryoWriter. Griglie per cryo-EM possono essere preparate con un tempo di attesa inferiore a 0,2 s tra l'applicazione di esempio e vetrificazione (dati non mostrati). Tuttavia, come proteine viaggiano a pochi decimi di un nanometro in pochi nanosecondi in diffusione, c'è ancora abbastanza tempo per loro entrare in collisione con l'interfaccia acqua-aria di un film di spessore campione nm 100 diverse volte. Tuttavia, la quantità di proteine che attacca all'interfaccia aria-acqua potrebbe essere significativamente ridotta di queste lacune di breve periodo di tempo e potrebbe prevenire la denaturazione proteica o limitato orientamento delle particelle. Un altro approccio promettente che potrebbe proteggere le proteine sensibili dall'interfaccia aria-acqua è di coprire il film campione di sostanze tensioattive di basso peso molecolare. Questi composti potrebbero essere rapidamente introdotti da una fase di condizionamento in cryoWriter prima della preparazione di griglia. L'elevato rapporto superficie-volume sistemi microfluidici è un'ulteriore limitazione del cryoWriter, come campione può potenzialmente essere perso di adsorbimento non specifico alla superficie microcapillary e disturbare l'analisi quantitativa di conteggio delle particelle. Il problema è risolto in due modi: in primo luogo, il campione non percorrere lunghe distanze all'interno del microcapillary. Infatti, il volume del campione nanolitro rimane all'estremità capillare in tutta l'elaborazione. In secondo luogo, la superficie in rapporto al volume è ulteriormente ridotto utilizzando microcapillari con diametri interni relativamente grandi, per esempio, 180 µm. in terzo luogo, le superfici dei microcapillari possono essere passivate facilmente, se necessario, ad esempio, trattandole con glicoli di etanolo polilisina commercialmente disponibile (PLL-PEG).
L'analisi ad alta risoluzione delle proteine mediante l'approccio di singola particella utilizzato in EM richiede solo 100.000 a qualche milione di immagini di particelle singole proteine. Ciò significa che la microfluidica tecniche possono fornire abbastanza complessi della proteina per l'indagine strutturale. Precedenti28è stato sviluppato un metodo di immuno-precipitazione miniaturizzati per il rapido isolamento dei complessi della proteina (circa 1 ora) dalla quantità di cellule minimal (circa 40.000 cellule). Questo metodo verrà ora essere collegato direttamente alla fase di preparazione del campione miniaturizzati della cryoWriter. L'obiettivo finale è quello di sviluppare una pipeline integrata microfluidici per preparazione griglia isolamento e cryo-EM proteina ultra-veloce che richiede meno di due ore in tutto. Inoltre, come dimostrato dalla Figura 6, la piccola quantita ' e il volume di materiale necessario per la preparazione del campione e la condizionata quasi senza perdita di dati e la procedura di preparazione griglia ottenuta utilizzando il cryoWriter, rendono possibile studiare la proteina complessi di singole celle. Insieme, il metodo miniaturizzati immuno-precipitazione e la cryoWriter porre le fondamenta di un nuovo metodo di proteomica chiamato "singola cella visual proteomics", come abbiamo recentemente dimostrato per shock termico esperimenti24. Algoritmi di analisi di dati orientati all'analisi delle immagini "visual proteomics" sono attualmente in fase di test.

Hardware e software per l'analisi strutturale dei complessi della proteina di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha avanzato in maniera massiccia negli ultimi anni. I miglioramenti apportati hanno aperto la strada a una "rivoluzione di risoluzione"1,2 e cambiato fondamentalmente ricerca strutturale. La rivoluzione è iniziata con l'avvento di cryo-elettrone microscopia (cryo-EM)3,4, che permette la preparazione di campioni biologici sotto vicino alle condizioni fisiologiche, diminuendo la sensibilità di radiazione e prevenendo evaporazione di campioni in alto vuoto del microscopio elettronico a trasmissione5. Negli anni successivi, il progresso tecnologico incrementale aumentato gradualmente la risoluzione ottenibile. Tra queste innovazioni erano l'applicazione dell'emissione di campo pistole6,7e, più recentemente, migliorato algoritmi di analisi di dati, ad esempio di massima verosimiglianza metodi8,9. Diretto di elettroni rivelatore telecamere10,11,12,13, film-modalità imaging e l'accompagnamento software sviluppi14,15, 16 , 17, fornito la svolta finale richiesta per raggiungere risoluzione atomica per campioni biologici dall'analisi di singola particella (per una recensione Vedi Cheng, Grigorieff, et al. 18). l'importanza di cryo-EM è stato recentemente riconosciuto dal premio del premio Nobel per la chimica a tre dei pionieri.
Per realizzare l'immagine un campione biologico da TEM, il metodo utilizzato per caricare la griglia EM con il campione (in seguito denominato «preparazione griglia») deve garantire che il livello risultante di campione (i) è abbastanza sottile (< 100 nm) per evitare rumore vasta di anelastica o moltiplicare sparsi gli elettroni, (ii) resiste l'alto vuoto del microscopio elettronico, e (iii) protegge le biomolecole da danno da radiazione. Due metodi principali vengono utilizzati per soddisfare questi prerequisiti: macchia negativa(NS)19,20 procedure (Figura 1A) adsorbire il campione ad una pellicola di carbonio sottile, incorporare le biomolecole amorfo heavy metal e poi permette il montaggio ad asciugare all'aria. Questo è semplice e veloce, e le griglie di EM caricate (in seguito denominate "griglie campione") sono facili da memorizzare e può essere conservata per lunghi periodi di tempo (in genere anni). In TEM, i preparativi esibiscono contrasto elevato dovuto il NS e tollerano dosi più elettroni che cryo-preparati, ma la risoluzione è limitata a circa 20 procedure Å. Cryo-EM (Figura 1B) impiegare holey carbonio supporta. Una sottile pellicola della soluzione del campione è misurata attraverso i fori e la griglia di EM è immerso in un criogeno, solitamente liquefatto etano, raffreddare rapidamente sotto-150 ° C. Il risultato è un amorfo, vetrificati, da 50 a 100 nm di spessore pellicola della soluzione nei fori di supporto. Questa pellicola sottile amorfa resiste l'alto vuoto nel microscopio elettronico e, nel caso ideale, conserva strutture biologiche nel loro stato nativo. La procedura permette di campioni biologici per l'imaging in alta risoluzione. Tuttavia, la griglia di esempio dovrà essere conservata a temperature sotto-150 ° C in ogni momento per evitare devetrificazione. Può essere imaged utilizzando dosi di elettrone relativamente elevato a causa della bassa temperatura, ma il contrasto e rapporto segnale-rumore è comunque basso. Di conseguenza, vengono impiegate tecniche in media per aumentare il contrasto e, purché il campione è ripreso da diverse angolazioni, una mappa ad alta risoluzione tridimensionale (3D) può essere ricostruita. Il più comunemente usato e metodo altamente efficace per la ricostruzione 3D a partire da ora è l'approccio di singola particella. Per una rassegna recente, vedere Cheng altri.18.
Macchia negativa TEM (NS-EM) è importante per la selezione ed il controllo di qualità, quando è necessario ad alto contrasto o quando sono disponibili solo limitate quantità di campione (adsorbimento alla pellicola di carbonio generalmente concentrati nell'esempio). Singola particella cryo-EM è il metodo standard di oro se ricostruzioni 3D ad alta definizione della struttura della proteina sono destinate per.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Figura 1: principi di TEM griglia preparazione e confronto tra il classico (pannello A, B) e un approccio di microfluidica (pannello C, D). A) preparazione griglia classica NS-EM: circa 3 µ l di campione sono pipettati a mano su una griglia di EM coperta con una pellicola di carbonio continuo (in seguito denominata una 'griglia NS-EM') (i). Dopo un'incubazione di circa 10 s, carta da filtro viene utilizzato per cancellare via il liquido in eccesso dal lato (ii), lasciando le biomolecole adsorbite in una pellicola sottile d'acqua. Successivamente, la proteina viene incubata in una soluzione di sale di metallo pesante, per esempio, acetato di uranile 2%, per 20 s (iii) e nuovo il liquido viene rimosso dal macchiare dal lato utilizzando carta da filtro (iv). Infine, la EM-griglia viene lasciata per asciugare all'aria. B) preparazione griglia classica cryo-EM: circa 3 µ l di campione sono pipettati da una mano su una pellicola di carbonio holey. Per formare una pellicola sottile del campione, il liquido in eccesso viene rimosso tramite carta-macchiare il faccia-su da uno o entrambi i lati (ii). Infine, la griglia è rapidamente immerso nell'etano liquido per la vitrificazione (iii). C) preparazione griglia NS-EM utilizzando il programma di installazione di cryoWriter: volume A 5 nL viene aspirato dal calcio campione utilizzando un microcapillary (i). Per condizionamento del campione, la punta di microcapillary è immerso nella soluzione condizionata, ad esempio, 2% di acetato di ammonio. Ioni e piccole molecole vengono scambiati tramite diffusione (ii). Si noti che le dimensioni del microcapillary garantiscono che l'intero processo è guidato di diffusione. Le proteine hanno molto inferiore costanti di diffusione degli ioni di sale e non sono significativamente perso24. Infine, il campione è erogato sulla griglia e lasciato asciugare (iii). D) principi di preparazione griglia cryo-EM utilizzando il metodo basato su cryoWriter: An EM griglia coperto con una pellicola di carbonio holey è posizionato sulla superficie di una piattaforma di controllo della temperatura e tenuto da pinzette. La temperatura della piattaforma è un offset dalla temperatura punto di rugiada dell'ambiente griglia. La griglia viene spostata rispetto a microcapillary contenente il campione e la microcapillary si abbassa fino a quando è alcuni micrometri sopra la griglia. Successivamente, pochi nanolitri di campione sono dispensati da esso, mentre la fase viene spostata in un modello a spirale; il liquido in eccesso è ri-aspirato (i). Dopo la griglia di EM di adescamento, il microcapillary è ritirato e la griglia rimane sulla piattaforma controllata di temperatura (successivamente indicati come punto di rugiada (DP) fase) per un breve periodo consentire una quantità controllata di campione di evaporare. Per immersione di congelamento, la griglia è rapidamente ritirata dal palco con le pinzette (ii), girata di 90° in posizione verticale e immerso in un bagno di criogeno (iii) (in seguito denominato 'pick-e-immersione' meccanismo). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I metodi di preparazione griglia utilizzati per NS e cryo-EM, purtroppo, non hanno migliorato significativamente da quando sono stati inventati. Svantaggi attuali sono il consumo di campionamento elevate (ca. 3 µ l di proteina di 1 mg/mL) e la grande quantità (> 99%) del campione ha perso (Figura 1A, B). Inoltre, il metodo classico utilizzato per preparare le griglie per cryo-EM è una procedura dura per proteine: in primo luogo, si tratta di un vasto faccia-su carta-blotting passo (Figura 1B, ii), e, in secondo luogo, la proteina è esposto all'interfaccia aria-acqua per una quantità significativa di tempo21. Qui, un metodo alternativo per esempio pre-condizionamento, preparazione del campione griglia e post-elaborazione (griglia essiccazione o vitrificazione) per NS-EM (Figura 1,C) o cryo-EM (Figura 1D) è presentato. L'installazione di costruito in-House, chiamato "cryoWriter", utilizza miniaturizzato campione gestione principi di tecnologia e microfluidica per aspirare, condizione e dispensare campione, evitando carta assorbente completamente e fornendo metodi alternativi ai campioni sottili per Cryo-EM. Si significativamente riduce il consumo del campione e migliora il controllo utente sulla preparazione del campione nel suo complesso. Inoltre, il metodo consente applicazioni sperimentali innovative; ad esempio la preparazione di componenti biologici isolati di singole celle in un approccio chiamato "singola cella visual proteomics"22,23,24,25.

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			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

A causa di recenti progressi tecnologici, cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) sta rapidamente diventando un metodo standard per l'analisi strutturale dei complessi della proteina a risoluzione atomica. Tuttavia, tecniche di isolamento della proteina e metodi di preparazione del campione per EM rimangono un collo di bottiglia. Un numero relativamente piccolo (100.000 per un paio di milioni) di particelle singole proteine devono essere imaged per l'analisi ad alta risoluzione delle proteine di singola particella approccio EM, rendendo miniaturizzato esempio gestione tecniche e principi di microfluidica fattibile.
Un metodo del preparazione di griglia EM miniaturizzato, carta-macchiare-gratuito per esempio pre-condizionata, adescamento griglia EM e post-elaborazione che consuma solo nanolitro-volumi di campione è presentato. Il metodo utilizza un sistema di erogazione con precisione sub-nanolitro per l'assorbimento di liquido di controllo ed EM griglia innesco, una piattaforma per controllare la temperatura della griglia definendo così l'umidità relativa di sopra della griglia di EM e un pick-e-tuffo-meccanismo per esempio vetrificazione. Per cryo-EM, una griglia di EM è disposto sulla fase a temperatura controllata e il campione viene aspirato in un capillare. La punta capillare è posizionata in prossimità di superficie della griglia, la griglia viene caricata con il campione ed eccesso è ri-aspirato nella microcapillary. Successivamente, il film campione è stabilizzato e leggermente assottigliato per evaporazione controllata acqua regolata dall'offset della temperatura piattaforma rispetto al punto di rugiada. In un dato punto viene attivato il meccanismo di prelievo-e-immersione, trasferire rapidamente la griglia EM innescata in etano liquido per la vitrificazione di campione. In alternativa, sono disponibili per preparare volumi di campione di dimensione nanolitro macchia negativa (NS) EM campione-condizionata metodi.
Le metodologie notevolmente riducono il consumo del campione ed evitare approcci potenzialmente dannosi alle proteine, come la carta da filtro assorbente usato nei metodi convenzionali. Inoltre, la minuscola quantità di campione richiesto consente nuove strategie sperimentali, come campione veloce condizionata, combinazione con cella singola Lisi per "visual proteomics", o "lossless" preparazione del campione totale per analisi quantitativa di campioni complessi.

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Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Metodi per la preparazione di volumi di campione dimensioni nanolitro per microscopia elettronica di trasmissione e uno strumento è presentato. Non macchiare di carta sono necessari passaggi, evitando così le conseguenze pregiudizievoli, che questo può avere per le proteine, significativamente riducendo la perdita del campione e consentendo l'analisi della singola cella lysata per proteomica di visual.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

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