Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить мастерской Biozentrum Базельского университета за их поддержку, S. A. Мюллер для критических дискуссий и тщательно читать рукопись, A. Fecteau-Лефевр для оказания технической помощи с EM, Рикардо Adaixo, Фрэнк Леманн для мембранных белков испытания образцов (все от C-Сина, Biozentrum, Университет Базеля) и A. Engel, Почетный Базельского университета за его вдохновляющее разговоров. Испытательные образцы были любезно предоставлены P. Ringler, м.-а. Махи и т. Швед (Biozentrum, Университет Базеля), P. Лейман (Лаборатория структурной биологии и биофизики, EPFL) и р. Диас Авалос (Нью-Йорк центр структурной биологии, США). Проект был поддержан Швейцарский Институт нанотехнологий (SNI, проект P1401, ARGOVIA проекта MiPIS) и Швейцарский Национальный научный фонд (SNF, проекта 200021_162521).

<ol>
	<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry:+The+resolution+revolution.">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>Bai, X. -. c., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology.">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li><li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions.">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, 89-102 (1983).</li><li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy.">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li><li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+gun+using+a+field+emission+source.">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li><li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expected+contribution+of+the+field-emission+gun+to+high-resolution+transmission+electron+microscopy.">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li><li>Milazzo, A. -. C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -. H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy.">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li><li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy.">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li><li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -. y., Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors.">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li><li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Cryo-EM+movie+data.">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy.">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy.">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+can+cryo-EM+become.">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li><li>Engel, A., Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+.">in .</a> Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. 96, 417-431 (2010).</li><li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., M&#252;ller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+&#181;-fluidics+to+electron+microscopy.">Connecting &#181;-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy.">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li><li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy.">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li><li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., M&#252;ller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBEB:+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements.">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).</li><li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+interactome:+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy.">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li></ol>

Авторы Штефан а. Арнольд, Хеннинг Штальберг и Томас Браун объявить следующие конкурирующих финансовых интересов: cryoWriter концепция является частью патентной заявке PCT / EP2015/065398 и EP16194230.

Инструмент «cryoWriter» и протоколы, необходимые для подготовки образца сетках для NS - и крио EM от nL размера общей выборки томов и полностью избежать классической промокательной бумаги шаг представлены. Microfluidic принципы и микромеханические системы объединены в cryoWriter чтобы сделать это возможным.
Наш опыт показывает, что при использовании миниатюрных методы, представленные в этой рукописи, параметр пространство для приготовления Эм сетки больше, чем для классических методов и под более жесткий пользовательский элемент управления. Главное достигнуто увеличение воспроизводимость позволяет предварительно просматривать с системой буфер образца, дополняет с легко доступных тестовых белка, чтобы определить оптимальные параметры перед фактической эксперимент выполняется. Это держит потребления образца интерес к абсолютной минимальной и настоятельно рекомендуется. Важнейшие шаги для подготовки сетки обоих NS - и крио EM являются: (i) Грунтовка насос системы; для суб nanoliter объем дозирования, система жидкости (воды) должен быть дегазации и пузырь бесплатно. (ii) точный контроль тлеющего разряда или плазменной очистки шаг; характеристики поверхности ет сетки имеют решающее значение для воспроизводимых результатов. (iii) образца принадлежности; время, необходимое для кондиционирования, например, с НС, зависит от типа буфера, содержание соли и концентрации (рис. 3), а также сопло геометрии микрокапиллярной24. (iv) испарения для NS-EM подготовки количественных Эм; кофе кольцо эффект может запретить количественный анализ NS-Эм препараты и должно быть подавлено медленно испарения, контролируемых DP-сцене.
Различные аспекты методов подготовки представленных сетки можно было свободно комбинировать, позволяя разработки универсальных протоколов для конкретных образцов. Типичными примерами бы удаления вещество, которое препятствует разрешением EM, например, глицерин, принадлежности шаг до подготовки сетки для крио Эм; Введение посредника молекул, например лигандов, по принадлежности перед готовятся сетки; или изучения одну ячейку lysate, NS - или крио Эм (рис. 6).
Использование микрофлюидика и минимальный пример сумм в представленные методы полностью устраняет необходимость промокательной бумаги шаги. Это большое преимущество, потому что промокательной бумаги жестокого обращения для белков, потенциально загрязнять образца с нежелательные ионы и неизбежно приводит к потере массивные образца. С другой стороны эффекты, потенциально вызванных воздух вода интерфейс тонкий образец пленке, образующейся при крио EM образцы подготавливаются в классической манере не избежать при использовании cryoWriter. Подходит для крио ет сетки может быть подготовлен с менее 0,2 s время ожидания между образца приложения и стеклования (данные не показаны). Однако как белки путешествовать несколько десятых долей нанометра в несколько наносекунд путем диффузии, есть еще достаточно времени для их столкновения с воздух вода интерфейс 100 Нм толщиной образца фильм несколько раз. Однако, количество белков, придерживаясь воздух вода интерфейс может быть значительно уменьшена эти пробелы в короткое время и может предотвратить денатурации белков или ограничено частиц ориентации. Еще один перспективный подход, который может защитить чувствительные белки от воздух вода интерфейс является для покрытия образца фильм с низкой молекулярной массой поверхностно-активных веществ. Эти соединения могут быть быстро введены принадлежности шаг в cryoWriter до подготовки сетки. Высокое отношение поверхности к объему microfluidic систем является дальнейшее ограничение cryoWriter, как пример потенциально могут быть потеряны при неспецифической адсорбционной на микрокапиллярной поверхность и нарушить количественный анализ путем подсчета частиц. Проблема решается двумя способами: во-первых, образец не преодолевать большие расстояния в пределах микрокапиллярной. Действительно объем образца nanoliter остается на капиллярной оконечности всей обработки. Во-вторых, поверхность соотношение объема далее уменьшается с помощью microcapillaries с относительно большим внутренним диаметром, например, 180 мкм. в-третьих, поверхностей microcapillaries может быть легко пассивируется, при необходимости, например, рассматривая их с коммерчески доступных polylysine этанола гликоли (PLL-PEG).
Высоким разрешением анализ белков от одной частицы подход, используемый в EM требует только 100 000 до нескольких миллионов изображений отдельных белковых частиц. Это означает, что методы microfluidic может обеспечить достаточно белковых комплексов для структурной расследования. Ранее28был разработан метод миниатюрных иммуно высыпание для быстрой изоляции белковых комплексов (примерно 1 час) от минимальной ячейки суммы (около 40 000 ячеек). Этот метод будет теперь напрямую связана с этапа подготовки миниатюрных образца cryoWriter. Конечная цель заключается в разработке комплексной microfluidic трубопровода для ультра-быстрой белка изоляции и крио ет сетки подготовки, что требует меньше чем за два часа во всех. Кроме того как показано на рисунке 6, минутный объем и объем материала, необходимые для подготовки проб и почти без потерь принадлежности и процедуры подготовки сетки с помощью cryoWriter, сделать это возможным для изучения белков комплексы отдельных клеток. Вместе метод миниатюрных иммуно осадков и cryoWriter заложить основы нового метода протеомики, под названием «одноклеточного визуальные протеомики», как мы недавно продемонстрировано для теплового шока эксперименты24. В настоящее время проводится тестирование алгоритмов анализа данных ориентирована на анализ изображений «визуальные протеомики».

Аппаратное и программное обеспечение для структурного анализа белковых комплексов, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) массово продвинулось за последние годы. Усовершенствования, внесенные проложили путь к «резолюции революции»1,2 и кардинально изменил структурных исследований. Революция началась с появлением крио электронная микроскопия (крио ЭМ)3,4, позволяя подготовка биологических образцов под рядом физиологических условиях во время уменьшения излучения чувствительность и предотвращения Пример испарения в высоком вакууме передачи электронного микроскопа5. В последующие годы добавочное технологический прогресс постепенно увеличивается резолюции достижимыми. Среди этих нововведений были применение пушки Автоэмиссионные6,7и, более недавно, улучшены алгоритмы анализа данных, например максимального правдоподобия методы8,9. Прямая электронная детектор камер10,11,12,13, кино режим изображения и сопровождающих программного обеспечения события14,15, 16 , 17, представила окончательный прорыв, необходимых для достижения атомной резолюции для биологических образцов, анализ одной частицы (для обзора см. Ченг, Григорьев, et al. 18). Присуждение Нобелевской премии по химии для трех из пионеров недавно признали важность крио EM.
Для биологической пробы по ТЕА, метод, используемый для загрузки ет сетки с образцом (впоследствии именуется как «сетка подготовка») должны обеспечить, что результирующий слой образца (i) является достаточно тонким (< 100 Нм) чтобы избежать обширный шум неэластичный или умножить разбросаны электроны, (ii) выдерживает высокий вакуум Микроскоп электрона, и (iii) защищает биомолекулы от радиационного повреждения. Две основные методы используются для выполнения эти предпосылки: отрицательные пятно(NS)19,20 процедур (рис. 1A) адсорбирует образца на тонких углеродных фильм, внедрить биомолекул в аморфных хэви-метал и затем Позвольте Ассамблее высохнуть на воздухе. Это простой и быстрый, и загружен ет сетки (впоследствии именуется как «образца сетках») легко хранить и может храниться в течение продолжительных периодов времени (как правило лет). В ТЕА подготовке демонстрируют высокую контрастность за счет NS и терпеть более высокие дозы электронов чем крио препараты, но резолюции ограничивается примерно 20 Å. крио-EM процедур, которые поддерживает (рис. 1Б) используют Холи углерода. Тонкая пленка образец решения охватывали через отверстия и сетке EM погружается в криогенное, обычно сжиженных этана, чтобы быстро охладить его ниже-150 ° C. В результате аморфные, керамические, 50-100 Нм толщиной фильм решения в поддержку отверстия. Этот тонкий, аморфные пленки выдерживает высокий вакуум в электронный микроскоп и, в идеальном случае, сохраняет биологические структуры в их родном государстве. Процедура позволяет биологических образцов для отображаемого в с высоким разрешением. Однако сетка образца должны храниться при температуре ниже-150 ° C на все время, чтобы избежать devitrification. Записи образа, используя сравнительно высокой электрона дозы из-за низкой температуры, но контраст и соотношение сигнал шум тем не менее является низким. Таким образом усреднения методы используются для увеличения контрастности и условии образец отображаемого под различными углами, с высоким разрешением трехмерные (3D) карта может быть реконструирован. Наиболее часто используемые и весьма успешный метод для 3D-реконструкции на сегодняшний день является одной частицы подход. Недавний обзор см Чэн al.18.
Отрицательный пятно ТЕА (NS-ЭМ) имеет важное значение для проверки и контроля качества, когда необходима высокая контрастность или доступны только ограниченное количество образцов (адсорбция углерода фильм обычно концентрируется образца). Одна частица крио EM является метод золотой стандарт, если с высоким разрешением 3D реконструкций структуры белков предназначены для.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Рисунок 1: подготовка сетки принципы ТЕА и сравнение между классической (Группа A, B) и microfluidic подход (группы C, D). A) классической NS-ет сетки подготовка: около 3 мкл пример накапаны вручную на сетке EM, покрыты пленкой непрерывной углерода (впоследствии именуемой «сетка NS-EM») (i). После инкубации около 10 s, фильтровальная бумага используется для пятно от лишней жидкости со стороны (ii), оставляя адсорбированных биомолекул в фильме тонкой воды. Впоследствии, белок инкубировали в раствор соли тяжелых металлов, например, 2% уранила ацетат, для 20 s (iii) и снова жидкость удаляется промокательной со стороны, с помощью фильтра бумаги (iv). Наконец EM-сетка оставляют сушиться на воздухе. B) классической крио ет сетки подготовка: около 3 мкл пример накапаны рукой на Холи углеродной пленки. Для формирования тонких образцов фильм, излишков жидкости удаляется промокательной бумаге лицо на одной или обеих сторон (ii). Наконец grid является быстро погрузился в жидкий Этан для витрификации (iii). C) NS-ет сетки подготовка с использованием cryoWriter установки: объем 5 nL придыханием из запасов образца с помощью микрокапиллярной (i). Для образца кондиционирования кончик микрокапиллярной погружен в раствор принадлежности, например, 2% Ацетат аммония. Малые молекулы и ионы осуществляется путем диффузии (ii). Обратите внимание, что размеры микрокапиллярной убедитесь, что весь процесс диффузии инициативе. Белки имеют гораздо ниже константы диффузии чем соль ионов и значительно не потеряли24. Наконец образец обойтись на сетке и разрешено сухой (iii). D) принципы подготовки крио ет сетки с помощью метода на основе cryoWriter: EM сетки, покрытой Холи углеродной пленки на поверхности платформы с контролируемой температурой и проведенных пинцетом. Температура платформы контролируется со смещением от температуры точки росы в Грид-среде. Сетке перемещается по отношению к микрокапиллярной, содержащие образец и микрокапиллярной опускается до тех пор, пока это несколько микрометров выше сетки. Впоследствии несколько нанолитров образца обойтись от него в то время как этап переехал в спирали; лишнюю жидкость повторно без наддува (i). После EM сетки грунтовка микрокапиллярной снимается и сетка остается на температуры контролируемых платформе (впоследствии именуются точки росы (DP) стадии) за короткое время, чтобы позволить контролируемых количество образца не испарится. Для ныряния замораживания сетка стремительно выведены от стадии с помощью пинцета (ii), перевернулся на 90° в вертикальной позиции и погрузился в ванну криогенное (iii) (впоследствии именуемой «забрать и погрузиться» механизм). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
К сожалению методы подготовки сетки, используемые для NS и крио ет не имеют значительно улучшилось, так как они были изобретены. Текущие недостатки являются высокий образец потребление (около 3 мкл белка 1 мг/мл) и большое количество образцов (> 99%) потерял (рис. 1А, B). Кроме того, классический метод, используемый для подготовки сетки крио EM это суровые процедуры для белков: во-первых, она включает в себя обширный лицом на промокательной бумаги шаг (рис. 1Б, ii), и, во-вторых, белок подвергается воздух вода интерфейс для значительное количество времени21. Здесь представлен альтернативный метод для образца предварительного кондиционирования, сетки пробоподготовки и пост-обработки (сетка сушки или стеклования) для NS-Эм (рис. 1C) или крио Эм (рис. 1D). Доме построен установки, под названием «cryoWriter», использует миниатюрных образец обработки принципы технологии и microfluidic аспирационная, состояние и отказаться от образца, избегая бумага полностью blotting и предоставляя альтернативные методы для тонких образцов для крио EM. Это значительно сокращает потребление образца и улучшает пользовательский элемент управления над пробоподготовки в целом. Кроме того метод позволяет Роман экспериментальных приложений; таких, как подготовка отдельных биологических компонентов отдельных ячеек в подход под названием «одноклеточного визуальные протеомики»22,23,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

Из-за недавних технологического прогресса крио электронной микроскопии (крио ЭМ) быстро становится стандартный метод структурного анализа белковых комплексов атомной резолюции. Однако белок изоляции методы и методы подготовки образца для EM оставаться узким местом. Относительно небольшое количество индивидуальных белковых частиц (100 000 до нескольких миллионов) нужно быть imaged для высокого анализа белков одной частицы EM подход, делая миниатюрных выборки, обработки, методы и принципы microfluidic это возможно.
Миниатюрных, бумага blotting свободные ет сетки подготовки для образца предварительного кондиционирования, ет сетки грунтовки и пост-обработки, который потребляет только nanoliter объемы выборки представлен метод. Этот метод использует систему дозирования с точностью суб nanoliter для контроля жидких поглощения и ет сетки грунтовки, платформа для контроля температуры сетки, определяя таким образом относительная влажность выше ет сетки и забрать и падение механизм для образца Витрификация. Крио EM ет сетки помещается на стадии контролируемой температурой и образец наддува в капилляр. Кончик капиллярного позиционируется в близости к поверхности сетки, сетка загружается с образцом и избыток повторно без наддува в микрокапиллярной. Впоследствии фильм образец стабилизировалась и слегка разбавленной испарением контролируемые воды регулируется смещение платформы температуры относительно точки росы. В данный момент забрать и падение механизм срабатывает, быстро передачи загрунтовать ет сетки в жидкий Этан для витрификации образца. Кроме того образец кондиционирования методы доступны для подготовки тома nanoliter размера выборки для отрицательных пятно (NS) EM.
Методологии значительно сократить потребление образца и избежать подходы потенциально вредных белков, таких как промокательной бумаги фильтр используется в обычных методов. Кроме того незначительное количество образца требуется позволяет Роман экспериментальных стратегий, таких как быстрый пример кондиционирования, комбинации с одноклеточных лизиса для «визуальные протеомики», или «без потерь» всего Пробоподготовка для количественного анализа сложные образцы.

Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Представлен документ и методы для подготовки томов nanoliter размера выборки для просвечивающей электронной микроскопии. Требуются шаги не промокательной бумаги, таким образом избежать пагубных последствий, которые это может иметь для белков, значительно снижает потери образца и включение анализа одной ячейки lysate для визуального протеомики.

Миниатюрных Пробоподготовка для просвечивающей электронной микроскопии

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Тандем Замораживание высокого давления и резких похолоданий Замена тканей растений для просвечивающей электронной микроскопии

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

И что нельзя делать крио-электронной микроскопии: учебник по пробоподготовки и высокое качество сбора данных для высокомолекулярных 3D реконструкции

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...