Name: miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Yazarlar için destek, S. A. Müller için kritik tartışmaları ve dikkatle el yazması, A. Fecteau-LeFebvre EM, Ricardo Adaixo, Frank konusunda teknik yardım almak için okumak için Basel Üniversitesi Biozentrum atölye teşekkür etmek istiyorum Lehmann membran protein için test örnekleri (tüm C-Çin, Biozentrum, Basel Üniversitesi) ve A. Engel, onun ilham verici konuşmalar için Basel Üniversitesi onursal. Test örnekleri nazikçe P. Ringler, M. A. tarafından sağlanan Mahi ve T. Schwede (Biozentrum, Basel Üniversitesi), P. Leiman (Laboratuvar yapısal biyoloji ve Biyofizik, EPFL) ve R. Diaz-Avalos (New York yapısal biyoloji Merkezi, ABD). Proje İsviçre Nanobilim Enstitüsü (sni ile proje P1401, ARGOVIA proje MiPIS) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF, proje 200021_162521) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry:+The+resolution+revolution.">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>Bai, X. -. c., McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology.">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li><li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions.">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, 89-102 (1983).</li><li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy.">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li><li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+gun+using+a+field+emission+source.">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li><li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expected+contribution+of+the+field-emission+gun+to+high-resolution+transmission+electron+microscopy.">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li><li>Milazzo, A. -. C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -. H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy.">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li><li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy.">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li><li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -. y., Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors.">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li><li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Cryo-EM+movie+data.">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li><li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy.">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy.">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+can+cryo-EM+become.">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li><li>Engel, A., Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+.">in .</a> Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. 96, 417-431 (2010).</li><li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., M&#252;ller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+&#181;-fluidics+to+electron+microscopy.">Connecting &#181;-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy.">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li><li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy.">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li><li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li><li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., M&#252;ller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=openBEB:+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements.">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84 (2014).</li><li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+interactome:+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy.">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li></ol>

Yazar Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg ve Thomas Braun aşağıdaki rakip finansal faiz beyan: cryoWriter kavramı PCT patent uygulamasının parçasıdır / EP2015/065398 ve EP16194230.

'CryoWriter' alet takımları ve örnek ızgaralar için NS - ve cryo-EM boyutlu nL toplam örnek birimlerden hazırlamak ve tamamen klasik kağıt kurutma adım önlemek için gerekli iletişim kurallarının sunulmaktadır. Mikrosıvısal ilke ve micromechanical sistem bu mümkün yapmak için cryoWriter içinde birleştirilir.
Bizim deneyim bu el yazması sunulan mini yöntemleri kullanıldığında, parametre alanı EM-kılavuz hazırlanması için klasik yöntemleri için ve sıkı Kullanıcı denetimi altında daha büyük olduğunu gösterir. Önemlisi, artan tekrarlanabilirlik elde gerçek deneme yapılmadan önce optimum parametreleri belirlemek için hazır test protein ile tamamlanmaktadır örnek arabellek sistemiyle ön ekran olanak sağlar. Bu örnek ilgi tüketimi için mutlak minimum tutar ve şiddetle tavsiye edilir. Her iki NS ve cryo EM kılavuz hazırlanması için kritik adımlar vardır: (i) emişli pompa sistemi; alt-nanoliter birimi dağıtımı için sistem sıvı (su) degassed olmalı ve ücretsiz kabarcık. (ii) kesin bir ışıma deşarj veya plazma adım temizlik denetim; EM ızgara yüzey özellikleri için tekrarlanabilir sonuçlar açısından büyük önem taşıyor. (iii) örnek Klima; Örneğin, NS, Merkezi Klima, için gereken süreyi ara bellek türü, tuz içeriği ve konsantrasyon (Şekil 3) yanı sıra microcapillary24meme geometrisini bağlıdır. (iv) buharlaşma oranlarını nicel EM NS-EM hazırlıkları için; kahve-ring etkisi kantitatif analiz NS-EM hazırlıkların yasaklayabilir ve yavaş buharlaşma oranlarını DP sahneyi tarafından kontrollü tarafından bastırılmış gerekir.
Sunulan ızgara hazırlama yöntemleri farklı yönlerini serbestçe belirli örnekleri için çok yönlü iletişim kuralları gelişimi sağlayan kombine edilebilir. Tipik örnekler Klima adım kılavuz hazırlık cryo-EM için önce yüksek çözünürlüklü EM, Örneğin, gliserol, engelleyen bir madde kaldırılması olacaktır; Arabulucu moleküllerin, Izgaralar hazır mısın önce Klima tarafından ligandlar, giriş; ya da tek hücre NS - veya cryo-EM tarafından (Şekil 6) lysate incelenmesi.
Havacilik ve sunulan yöntemler miktarlarda en az örnek kullanımı tamamen kağıt kurutma adımları gereksinimini ortadan kaldırır. Bunun büyük bir avantaj nedeni kağıt kurutma proteinler, potansiyel olarak istenmeyen iyonları ile örnek kirletici ve doğal olarak büyük örnek kaybı için önde gelen sert bir tedavidir. Öte yandan, cryoWriter kullanıldığında potansiyel olarak hava-su arabirimi cryo-EM örnekleri klasik şekilde hazırlanır zaman ince örnek film nedeniyle etkileri önlenmesini değil. Izgaralar cryo-EM için uygun örnek uygulama ve Vitrifiye (veri gösterilmez) arasında daha az 0.2 s bekleme süresi ile hazırlanabilir. Ancak, protein bir nanometre birkaç nanosaniye birkaç onda tarafından difüzyon seyahat gibi hala var. onları 100 nm kalın örnek film hava-su arayüzü ile birkaç kez çarpışmak yeterli zaman Ancak, hava-su arabirimine yapışmasını protein miktarı önemli ölçüde bu kısa sürede boşlukları tarafından azaltılmış olabilir ve proteini denatürasyon engelleyebilir veya kısıtlanmış parçacık yönlendirme. Hassas proteinler hava-su arabiriminden korumak olabilir başka bir umut verici yaklaşım düşük moleküler ağırlıklı yüzey-aktif maddeler maddeler tarafından örnek film karşılamaktır. Bu bileşiklerin hızla bir klima adım kılavuz hazırlık önce cryoWriter'tarafından tanıtıldı. Örnek potansiyel olarak belirsiz adsorpsiyon tarafından microcapillary yüzeye kayıp olabilir ve kantitatif analiz parçacık sayma tarafından rahatsız mikrosıvısal sistemlerinin yüksek yüzey hacim oranı cryoWriter daha fazla bir kısıtlamasıdır. Sorunu iki şekilde ele: ilk olarak, örnek microcapillary içinde uzun mesafelerde seyahat değil. Gerçekten de, nanoliter numune hacmi kapiler uç işleme boyunca kalır. İkinci olarak, hacim oranı yüzeye daha da microcapillaries nispeten büyük iç çapları, Örneğin, 180 µm. ile üçüncü kullanarak azalır, microcapillaries yüzeylerin kolayca gerekirse, düzgünleştirilecek onları tedavi tarafından Örneğin, piyasada bulunan polylysine etanol glikoller (PLL-PEG) ile.
Proteinler tarafından EM içinde kullanılan tek parçacık yaklaşımı yüksek çözünürlüklü analiz sadece 100.000 bireysel protein parçacıkların bir kaç milyon resimlere gerektirir. Bu mikrosıvısal teknikleri yapısal soruşturma için yeterli protein kompleksleri sağlayabilir anlamına gelir. Protein kompleksleri (yaklaşık 1 saat) (yaklaşık 40.000 hücreleri) en az hücre tutarlardan hızlı yalıtım için bir mini IMMUNO-yağış yöntemi önceki28geliştirilmiştir. Bu yöntem artık doğrudan cryoWriter küçültülmüş örnek hazırlık aşaması için bağlanır. Nihai amaç az iki saat içinde tüm gerektiren ultra-hızlı protein yalıtım ve cryo-EM kılavuz hazırlanması için bir tümleşik mikrosıvısal boru hattı geliştirmektir. Ayrıca, Şekil 6, dakika tutar ve numune hazırlama ve neredeyse kayıpsız klima ve cryoWriter kullanılarak elde kılavuz hazırlama prosedür için gerekli malzemenin hacmi gösterildiği gibi protein çalışma olanak sağlar tek tek hücreleri kompleksleri. Birlikte, biz son zamanlarda Isı şok deneyler24için gösterildiği gibi minyatür IMMUNO-yağış yöntemi ve cryoWriter "tek hücre görsel proteomik" adlı yeni bir proteomik yöntemi temeli yatıyordu. "Görsel proteomik" görüntüleri analiz için tasarlanmış veri analizi algoritmaları şu anda test edilmektedir.

Donanım ve yazılım protein kompleksleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından yapısal analizi için ağır son yıllarda gelişmiş. Yapılan iyileştirmeler "çözünürlük devrimi"1,2 yol açtı ve temelde yapısal araştırma değişti. Radyasyon duyarlılık azaltılması ve önlenmesi ise hazırlık yakın fizyolojik koşullar altında Biyolojik örneklerin izin cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM)3,4, advent ile devrim başladı Transmisyon Elektron mikroskobu5örnek buharlaşma yüksek vakum. Takip eden yıllarda, artan teknolojik ilerleme yavaş yavaş ulaşılabilir çözünürlük artar. Bu yenilikler arasında uygulama alanı-emisyon silah6,7vardı ve daha yakın zamanlarda, geliştirilmiş veri analizi algoritmaları, maksimum olabilirlik yöntemleri8,9gibi. Doğrudan elektron dedektörü kameralar10,11,12,13, film-tarz görüntüleme ve eşlik eden yazılım gelişmeler14,15, 16 , 17, sağlanan tek parçacık analizi (için bir daha gözden geçirme bkz: Cheng, Grigorieff, vd tarafından biyolojik örnekler için atomik çözünürlük elde etmek için gerekli son atılım 18). cryo-EM önemini yakın zamanda üç pioneers kimya Nobel Ödülü Ödülü tarafından tanındı.
TEM tarafından biyolojik bir örnek görüntü için örnek (daha sonra "kılavuz hazırlık" anılacaktır) ile EM kılavuz yüklemek için kullanılan yöntemi elde edilen örnek katmanı (i) yeterince ince olduğundan emin olmalısınız (< 100 nm) geniş sesini tarafından esnek olmayan önlemek ya da çarpmak için dağınık Elektron, (ii) dayanıklı elektron mikroskobu yüksek vakum ve (III) biomolecules radyasyon zararlardan korur. Bu perquisites yerine getirmek için iki ana yöntem kullanılır: negatif leke(NS)19,20 yordamları (Şekil 1A) örnek bir ince Karbon film için absorbe, amorf ağır metal biomolecules embed ve sonra havada kurumaya derleme izin. Bu basit ve hızlı, ve (daha sonra "örnek ızgaralar" da adlandırılır) yüklü EM ızgaralar basit-e doğru saklamak ve uzun bir süre için tutulabilir (genellikle yıl). TEM, ürünleri yüksek karşıtlık NS nedeniyle sergi ve yüksek elektron dozda cryo-hazırlıklar daha tahammül, ancak çözünürlük (Şekil 1B) istihdam delikli karbon destekler yaklaşık 20 Å. Cryo-EM yordamlar sınırlıdır. Örnek çözüm ince bir film delikleri arasında yayılmış ve EM kılavuz bir cryogen, genellikle sıvılaştırılmış etan-150 ° c altında hızla sakin, içine daldı Sonuç bir amorf, vitrifiye, 50-100 nm-kalın film çözüm destek delik. Bu ince, amorf film elektron mikroskobu yüksek vakum dayanmaktadır ve ideal durumda, yerel durumlarına biyolojik yapıları korur. Yordam, yüksek çözünürlüklü yansıması biyolojik örnekler verir. Ancak, örnek kılavuz aşağıdaki sıcaklıklarda-150 ° C devitrification önlemek için her zaman tutulmalıdır. Düşük sıcaklık ama karşıtlığı nedeniyle nispeten yüksek elektron dozlarda kullanılarak görüntüsü ve sinyal-gürültü oranı yine de düşük. Bu nedenle, ortalama teknikleri kontrastı arttırmak için istihdam edilmektedir ve sağlanan örnek--dan farklı açı görüntüsü, bir yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) harita yeniden olabilir. En sık kullanılan ve tek parçacık yaklaşım bugün itibariyle 3D yeniden inşası için son derece başarılı yöntemdir. Son bir reklam için Cheng al.18' e bakın.
Yüksek karşıtlık gerek duyulduğunda veya örnek yalnızca sınırlı miktarda kullanılabilir olduğunda negatif leke TEM (NS-EM) tarama ve kalite kontrol için önemli (adsorpsiyon Karbon film genellikle yoğunlaşmaktadır örnek). Tek parçacık cryo-EM altın standart yöntem ise protein yapısının yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonu için amaçlanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> Resim 1: TEM ilkeleri kılavuz hazırlanması ve klasik (panel A, B) ve bir mikrosıvısal yaklaşım (masası C, D) arasında karşılaştırma. A) klasik NS-EM kılavuz hazırlık: hakkında 3 µL örneği pipetted el ile (daha sonra bir 'NS-EM tablo' da adlandırılır) bir sürekli Karbon film ile kaplı bir EM ızgara üzerine (ı). Yaklaşık 10 için kuluçka sonra s, filtre kağıdı uzak adsorbed biomolecules bir ince su film bırakarak aşırı sıvı (II), taraftan leke için kullanılır. Daha sonra protein inkübe bir heavy metal tuz solüsyonu, Örneğin, %20 2 uranyl asetat s (III) ve tekrar sıvı filtre kağıdı (IV) kullanarak taraftan Blot tarafından kaldırılır. Son olarak, EM-grid havada kurumaya bırakılır. B) klasik cryo-EM kılavuz hazırlık: hakkında 3 µL örnek bir delikli Karbon film üzerine bir el tarafından pipetted. Bir ince örnek film oluşturmak için fazla sıvı kağıt kurutma görülen bir veya her iki taraftan da (II) tarafından kaldırılır. Son olarak, grid hızla Vitrifiye (III) için sıvı etan içine gömülür. C) cryoWriter kurulumu kullanarak NS-EM kılavuz hazırlık: A 5 nL birim bir microcapillary (i) kullanarak örnek stoktan Aspire. Merkezi Klima örnek için microcapillary ipucu Klima çözüm içine, Örneğin, %2 amonyum asetat batırılır. İyonları ile küçük moleküllerin difüzyon (II) tarafından değiştirilir. Microcapillary boyutları tüm süreç odaklı difüzyon olduğundan emin olun unutmayın. Protein çok daha düşük difüzyon sabitler Tuz iyonları daha sahiptir ve önemli ölçüde24kayıp değil. Son olarak, örnek kılavuz reçete ve (III) kuru izin. D) cryoWriter tabanlı yöntemi kullanma cryo-EM kılavuz hazırlama ilkeleri: delikli Karbon film ile kaplı bir EM kılavuz ısı kontrollü bir platform yüzeyine yerleştirilen ve cımbız tarafından düzenlenen. Platform sıcaklığını çiğ noktası sıcaklık ızgara çevrenin bir uzaklığındaki kontrol edilir. Kılavuz örnek içeren microcapillary göre taşınır ve bu kılavuz yukarıda birkaç mikrometre bitene microcapillary indirilir. Sahne bir sarmal Model taşındı iken daha sonra örnek bir kaç nanoliters ondan kalmaması sağlanmaktadır; aşırı sıvı yeniden emişli (i). EM kılavuz, priming sonra microcapillary içine kapanık ve (daha sonra çiğ noktası (DP) sahne da adlandırılır) sıcaklık kontrollü platform örnek buharlaşır için kontrollü bir miktar izin vermek kısa bir süre için kılavuz kalır. Buz gibi atılmak için kılavuz hızla cımbız (II) kullanarak sahne alanı'ndan geri 90 ° dikey pozisyona saygısız ve (daha sonra 'çekme ve dalma' mekanizması olarak da adlandırılır) cryogen banyo (III) daldı. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ne yazık ki, NS ve cryo-EM için kullanılan ızgara hazırlama yöntemleri önemli ölçüde geliştirilmiş onlar icat edildi bu yana değil. Yüksek örnek tüketimi (1 mg/mL protein yaklaşık 3 µL) geçerli sakıncaları vardır ve büyük miktarda örnek (> %99) (resim 1A, B) kaybetti. Ayrıca, ızgaralar cryo-EM için hazırlamak için kullanılan klasik yöntem bir sert proteinler için işlemdir: ilk olarak, bu bir geniş görülen kağıt kurutma adım (Şekil 1B, II) içerir, ve, ikinci olarak, protein hava-su arabirimi için maruz kalmaktadır Saat21önemli bir miktar için. Burada, ön şartlandırma örnek için alternatif bir yöntem, örnek kılavuz hazırlık ve (kılavuz kurutma veya vitrifikasyon) NS-EM (Şekil 1C) veya cryo-EM (Şekil 1D) için son işlem sunulmaktadır. "CryoWriter" denilen içi yapılı Kur küçültülmüş örneği teknoloji ve mikrosıvısal ilkeleri işleme Aspire edin, koşul ve örnek, tamamen kurutma ve ince örnekleri için alternatif yöntemler sağlayan kaçınarak kağıt dağıtmak için kullanır Cryo-EM. Bu önemli ölçüde örnek tüketimini azaltır ve numune hazırlama bir bütün olarak üzerinde kullanıcı denetimini artırır. Ayrıca, yöntemi roman deneysel uygulamalar sağlar; "tek hücre görsel proteomik"22,23,24,25denilen bir yaklaşım tek tek hücreleri izole biyolojik bileşenleri hazırlanması gibi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1080px;" width="1079">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Liquid handling</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microcapillary tip</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>FS360-100-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 100 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td>FS360-150-30-N-20</td>
			<td>SilicaTips 30 &#181;m tip ID, 150 &#181;m ID , pk. 20</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Conductive sleeve</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>CONGAS-1&#160;</td>
			<td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fused silica tubing</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>TSP-150375</td>
			<td>TSP Standard FS Tubing, 150 &#181;m ID, 363 &#181;m OD, 5 meter</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PressFit Connector</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>2525LD</td>
			<td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe 10 &#181;l</td>
			<td>BGB-Analytik</td>
			<td>HA-80001</td>
			<td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump controller</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000093</td>
			<td>neMESYS controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Syringe pump dosing unit</td>
			<td>Cetoni</td>
			<td>A3921000095</td>
			<td>neMESYS dosing unit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Dew point sensor</td>
			<td>Meltec</td>
			<td>UFT75-AT</td>
			<td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Temperature sensor</td>
			<td>Sensorshop24.ch</td>
			<td>LS7-PT1000-1.0-3L</td>
			<td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier controller</td>
			<td>Cooltronic</td>
			<td>TC2812&#160;</td>
			<td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Peltier element</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-127-14-15-S</td>
			<td>40x40 mm</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water-cooling block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water pump</td>
			<td>Digitec.ch</td>
			<td>294877</td>
			<td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Water heat exchanger block</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small water coolers</td>
			<td>PCHC.ch</td>
			<td>223050</td>
			<td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small peltier elements</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>PE-031-10-15-S</td>
			<td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &#176;C, 2 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mechanics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Linear stage z-axis</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>M-404.2PD</td>
			<td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Stage controller</td>
			<td>Dyneos AG</td>
			<td>C-863</td>
			<td>Mercury Servo Controller</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Microscope xy-axis stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIL5</td>
			<td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small permanent magnets</td>
			<td>Supermagnete</td>
			<td>S-05-08-N</td>
			<td>Rod magnet &#216; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Small electromagnet</td>
			<td>Schramme</td>
			<td>EG1025A02/110</td>
			<td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Controller electromagnet</td>
			<td>Conrad.ch</td>
			<td>MST-1630.001 7</td>
			<td>Electromagnet control PCB board</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Solenoid hub</td>
			<td>Distrelec.ch</td>
			<td>HD8286-R-F-24V100%</td>
			<td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Mini tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0302-M5S-PS</td>
			<td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various optomechanical parts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Various mechanical parts</td>
			<td>Workshop Biozentrum, University Basel</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Optics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Laser diode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPS780S</td>
			<td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Photo detector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">EM grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="15">
			<td height="15" style="height:15px;">DURASIN FILM TEM</td>
			<td>emsdiasum.com</td>
			<td>DTF-03523</td>
			<td>30 nm DuraSiN&#8482; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:197px;">Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Buffers / Neg. stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537&#160;SIGMA</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoVan 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain vanadium based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">NanoW 2%</td>
			<td>nanoprobes.com</td>
			<td></td>
			<td>Negative stain tungsten based</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">openBEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td colspan="2" height="16" style="height:16px;">CryoWriter control software (openBEB plugin)</td>
			<td></td>
			<td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

Son teknolojik ilerleme nedeniyle cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) hızla protein kompleksleri atomik çözünürlükte yapısal analizi için standart bir yöntem haline geliyor. Ancak, protein yalıtım teknikleri ve örnek hazırlama yöntemleri için EM bir darboğaz kalır. Bireysel protein parçacıklar nispeten az sayıda (100,000 birkaç milyon) proteinler yüksek çözünürlüklü analiz için tek parçacık EM yaklaşım, kırılan örnek işleme teknikleri ve mikrosıvısal ilkeleri yapım tarafından yansıması gereken uygulanabilir.
Örnek ön Klima, EM kılavuz astar ve yalnızca nanoliter-örnek hacimleri tüketir işlem sonrası için bir minyatür, kağıt-Blot ücretsiz EM kılavuz hazırlama yöntemi gösterilir. Yöntem bir dağıtım sistemi kontrol sıvı alımı ve EM kılavuz astar, bir platform için alt-nanoliter hassasiyetle böylece belirleme bağıl nem EM kılavuz ve çekme-ve-dalma-için bir mekanizma örnek yukarıda kılavuz sıcaklık denetlemek için kullanır Vitrifiye. Cryo-EM, EM kılavuz ısı kontrollü sahnede yer alıyor ve örnek bir kılcal damar Aspire. Kapiler uç ızgara yüzeyi bir mesafede konumlandırılmış, kılavuz ile örnek yüklenir ve aşırı microcapillary yeniden emişli. Daha sonra örnek film stabilize ve biraz platformu sıcaklık çiğ noktası göreli uzaklığı tarafından kontrollü su buharlaşma ile inceltilerek. Belirli bir noktada hızla içine sıvı etan örnek vitrifikasyon için astarlanmalıdır EM kılavuz aktarma çekme ve dalma mekanizma tetiklenir. Alternatif olarak, örnek-Klima yöntemleri örnek nanoliter boyutlu birimleri negatif leke (NS) EM hazırlamak kullanılabilir.
Metodolojisi büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve filtre kağıdı kurutma geleneksel yöntemlerde kullanılan gibi yaklaşımlar zararlı proteinler, kaçının. Ayrıca, gerekli örnek küçük miktarda gibi hızlı örnek tek hücre lizis için "görsel proteomik" or "kayıpsız" Toplam numune hazırlama Nicel analiz ile Merkezi Klima, roman deneysel stratejileri sağlar karmaşık örnekleri.

"CryoWriter" Kur ( Şekil 2' deki görülen) Şekil 1C, Dönerilen küçültülmüş EM kılavuz hazırlama prosedürleri test amacıyla geliştirilmiştir. Resim 2 A bir ters floresans mikroskobu monte çeşitli bileşenlerinin özetini gösterir. Hücre kültürü çalışmalarının modülü mikroskop sol tarafında yüklü; EM kılavuz hazırlık için bir modül sağda yer alır. Hücre kültürü çalışmalarının modülü (Şekil 2B) tarafından ışık mikroskobu yapisan ökaryotik hücrelerin büyümesini ve hücre kültürü canlı hücre görüntüleme sağlar. Tek tek hücreleri ozmotik şok, Elektroporasyon ve hücre içeriğinin aspirasyon microcapillary (resim 2B, Şekil 6A)24,25içine kombine eylem tarafından lysed. Emişli lysate örnek daha sonra ızgaralar NS - veya cryo-EM için hazırlamak için kullanılabilir. Alternatif olarak, bir hisse senedi protein çözüm PCR tüp içinde örnek kaynağı olabilir. İstihdam microcapillary (resim 2B) bir yüksek-tamlık pompa sisteminde emişli ve alt-nL hassasiyetle kalmaması için örnek birimlere bağlı. Protokolleri ayrıntılı olarak tüm örnek işleme bu microcapillary içinde veya EM kılavuz kendisi önemli örnek ulaşım olmadan gerçekleştirilir. Örneğin, aynı microcapillary tek tek ökaryotik hücreleri parçalayıcı, lysate Aspire edin, bu durumu ve son olarak aliquots EM ızgaralar üzerine dağıtmak için kullanılır. Kılavuz hazırlık modülü tam kontrollü (Şekil 2C) olmak üzere yerleştirilen EM kılavuz sıcaklığı sağlayan hareketli bir DP-sahne oluşur. NS-TEM için hazırlanmış örnek kılavuz sonra sadece soğuk sahne alanı'ndan kaldırılır ve oda sıcaklığında havada kuru izin. Ancak, o zaman neden olabilir sözde kahve-ring etkileri nerede protein 'parçacıklar' sayılır nicel TEM için kaçınılması gerekir. Izgaralar bunu yapmak için yavaş yavaş sıvı buharlaşma yavaş yavaş yavaş artan bir sıcaklık gradyanı kullanarak DP sahnede kurutulur. Cryo-EM için kılavuz sıcaklığını çiğ noktası yakın tutulur; gerekirse bir algılayıcı tarafından izlenebilir kontrollü buharlaşma örnek sıvı ince film istikrar ve inceltme, için izin vererek pozitif bir uzaklığı yaklaşık 8 ° c seçilir26. Seçilen inceltme zaman sonra bir çekme ve dalma mekanizma etkinleştirilir ve örnek Vitrifiye (Şekil 2C). Dalan bu mekanizma oda sıcaklığında saklanan NS-EM ızgaralar için gerekli değildir unutmayın.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig2.jpg"> Resim 2: cryoWriter ayarının Özeti. A) cryoWriter ayarının Özeti monte bir ters ışık-mikroskobunun (1). B) iç metin alanının bir minyatür PDMS tabanlı hücre kültür plaka (4) yer alan örnek manipülasyon ve hücre lizis için microcapillary (3) ile panelinde A. hücre kodlamayla yuvası (2), sol tarafında gösterilir. C) iç metin alanının belirtilen paneli A. 'çekme-ve-dalma' mekanizması içinde sağ tarafta. Delikli Karbon film EM kılavuz (5) Cımbız (6) ipuçları arasında monte edilmiş ve ana metin çiğ noktası sahne (DP-sahne) adı verilen doğrudan temas ısı kontrollü evre (7), yatay olarak yerleştirilmiş. Sahne sıcaklık sıkı bir PID denetleyicisi ve, ya da çiğ noktası sıcaklığı, ortam ortama bağlı yakın tutmak bir su soğutmalı Peltier öğesi üzerinden kontrol edilir. DP-Etap (7) ızgara microcapillary göre hareket için bir motorlu xy eksende monte edilir. Microcapillary kendisi z sahnede monte ve çok EM kılavuz yüzeye yakın olana indirdi ve nanoliter ölçekli (sürekli ince karbon için bir katman NS-EM veya cr için delikli Karbon film kapsayan örnek Destek birimlerini dağıtmak için kullanılan Yo-EM). Sıvı alımı ve dağıtımı yapılır ki yüksek hassasiyetli pompa sistemi (8) kullanarak unutmayın. Kullanılmış sıvı bir sarmal şeklinde kılavuz microcapillary göre hareket ettirerek dağıtılabilir. Cryo-EM hazırlık için çekme ve dalma dondurucu mekanizması (9) hızla içine sıvı etan (10) hızlı soğutma ve örnek vitrifikasyon örnek yüklü kılavuz aktarır. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Şekil 3 cryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan NS-EM ızgaralar için elde temsilcisi sonuçları gösterir. Microcapillary ucu 5 ile dolu olduğunu nL bir hisse senedi çözümden örnek ve birkaç dakika için NS çözüm (%2 methylamine tungstate) bir rezervuar içine daldırma galvaniz NS ve Tuz iyonları diffusive değişimine izin ver (Arnold, teorik için bkz et Al. 24). daha sonra klimalı örnek bir NS-EM ızgara ince Karbon film reçete ve kurutulmuş. Şekil 3 A kantitatif TEM için gerektiği gibi tam damlacık görselleştirmek için aynı şekilde bir yuvası ızgara kullanımını gösterir. Kahve yüzük etkisi önlemek amacıyla, taze glow taburcu kılavuz başlangıçta çiğ noktası sıcaklığı (su buharlaşma) düzenlenen ve yavaş yavaş DP sahnede ısıtacağız. Unutmayın, çoğu uygulama için (Örneğin, kalite kontrol örnek veya yapısal analizi) değil yavaş kuruyan bu işlem gereklidir. Yüksek kaliteli NS-hazırlıklar Şekil 3B, Cgösterildiği gibi o olmadan elde edilir. Klima fosfat içermeyen düşük tuz arabellekleri için yaklaşık 3 dk, Örneğin, düşük tuz Tris-tampon (20 mM Tris-HCl pH 7.4 ile 50 mM NaCl), ile tütün mozaik virüsü (TMV) kullanarak Şekil 3B gösterildiği örnek olarak zamanlardır. Şekil 3 TMV PBS arabellekte (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) olduğu gibi C bir en kötü durum senaryosu sunar. Fosfat iyonları gerekli Klima zaman (7 dakika) uzatma geçici kristaller (bkz Şekil 5C) NS, ağır metal iyonları ile oluşturur. Diğer ağır metal tuzları da kullanılabilir kılavuz hazırlık modülü, Örneğin, %2 methylamine vanadat veya amonyum molibdat ile (Ayrıca Arnold, et al. bkz: 24). ancak, uranyl asetat uygun; değildir Adsorpsiyon bir karbon film önce (bkz Şekil 5E)23protein örnek çözümü, şartına Eğer bu leke crosslinking etkisi için toplamları açar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig3.jpg"> Şekil 3: tipik sonuçları Şekil 1' deCbelirtildiği gibi cryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan NS ızgaralar için. A) bir yuvası ızgara üzerinde Klima ile % 2 methylamine tungstate sonra reçete 3 nL damlacık görüntüsünü genel bakış. B) 20 mM TRIS arabelleği TMV. İlave bir 3 x büyütme belirtilen bölge gösterir. Arnold, et al.24 uyarlanmış (excerpted malzeme ilgili ilave izinleri yönetmen için ACS). C) tütün mozaik virüsü (TMV) PBS arabelleği. İlave bir 3 x büyütme belirtilen bölge gösterir. Arnold, et al.24 uyarlanmış (excerpted malzeme ilgili ilave izinleri yönetmen için ACS). Ölçek çubukları: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
CryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan cryo-EM ızgaralar için elde tipik sonuçları Şekil 4' te tasvir edilmektedir. Paneli 4A vitrifiye örnek tarafından bölgeyi kılavuz Atlası gösterir. Paneli 4B vitreus buz polimerlerin bir seçili kılavuz yuvasında gösterir. Her iki durumda da, 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl arabellek % 0.05 Fos 14 deterjan içeren örnek oldu. Birçok örnekleri ve arabellekleri test edildi ve karşılaştırılabilir yüksek kalite vitreus buz elde edildi, ama gerekli koşullar arabellek bağımlı (Ayrıca bkz: tartışma Şekil5). Panel 4C apoferritin parçacıklar ve bir bakteriyofaj kontrastı arttırmak için yüksek odak yansıma Tris-HCl tampon (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7,4) gösterir. Panel 4D amphipoles tarafından stabilize bir 200 kDa membran protein gösterir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig4.jpg"> Şekil 4: tipik sonuçları Şekil 1' deDbelirtildiği gibi cryoWriter Kur kullanılarak hazırlanan cryo-EM ızgaralar için. Örnekleri ve arabellekleri gösterilen örnekleri değişir. Tüm örneklerini delikli karbon filmler doluydu. A) kolaj bir 150 kDa membran protein, vitreus buz çevre içeren örneği ("kılavuz atlas") genel bakış görüntülerin Beyaz oklarla belirtilir. B) büyütülmüş kılavuz yuvadan vitreus buz ile delikli Karbon film gösterilen aynı arabellek ile hazırlanan bir kılavuz. Bazı delikler Beyaz oklarla gösterilmiş örnek arabellek ile dolu değil. C) karbon delikle vitrifiye örnek apoferritin protein kompleksleri ve bacteriophages içeren. İç metin: bir bakteriyofaj kuyruğunun gösterilen iki kat büyütme. Beyaz yıldız işareti karbon film gösterir. Not görüntü kontrastı arttırmak için yüksek odak ile kaydedildi. D) A 200 kDa membran protein amphipols içinde yeniden düzenlendi. İç metin: belirtilen bölgesinin yüksek kontrast ile gösterilen bir 2 x büyütme. Ölçek çubukları: A, 100 µm; B, 10 µm; C ve D, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
CryoWriter Kur optimal EM-grid hazırlık koşullar için eleme sistematik sağlar; Şekil 5içindeA bir örnek gösterilmiştir (25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl, % 0.05 apoferritin Fos 14). Bu deneyde, "sıcaklık inceltme" vitreus buz çeşitli, ama inceltme zaman (yani, örnek uygulama ve dalma donma arasındaki zaman aralığı) sabit kaldı (1 s). Düşük mahsup sıcaklıklarda (Örneğin, 8 K), örnek tabakası çok kalın. Mahsup daha yüksek sıcaklıklarda, deliklere vitreus buz ince (10 K, 12 K), (yukarıda 18 K) bazı aşamada kılavuz tamamen kabul edilene kadar kuru (değil gösterilir). Sonuçları burada, siyah oklarla gösterilmiş bir uzaklık 12 K kurşun vitreus buz büyük bir homojen bölgesine sunulan. Bu en iyi duruma getirme deneyler "test" proteinler (örneğin, apoferritin) kullanarak hedef örnek arabelleği ile gerçekleştirilebilir. En iyi koşullarda bulundu daha sonra hedef örneğine uygulanır. Ayrıca, ızgaralar uzak optimum parametreleri ile hazırlama işlemi sırasında sık sık tanınır ve elektron mikroskobu, önemli zaman tasarrufu taranması gerekmez. Şekil 5 de tipik cryo-EM (masası B) ve NS-EM (E panelleri C) eserler bir galeri cryoWriter kurulum belirli gösterir. Cryo-EM ızgara paneli 5B % 0,1 disil-β-D-maltopyranoside (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.4, 0.1%DM) içeren PBS TMV ile gösterilen aşırı inceltilerek. Görüntünün arka plan grenli çünkü tuz konsantrasyonu çok yüksek oldu. Genel olarak, bir örnek görsel görünümünü tuz konsantrasyonunun doğrusal bir fonksiyon olmak görünmüyor; bir eşik konsantrasyon inceltme işlemi sırasında ulaşıldığında tahıl aniden önemli olmak. İstenmeyen maddeleri bir klima adım kılavuz hazırlık önce tarafından kaldırılabilir Protokolü bölümü 1,6 NS-EM için açıklandığı gibi not. NS diğer yapıları neden olabilir. Panel 5 C gösterilen örnekte, PBS arabellek (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) örnek olmadan 3 dk. Precipitates için % 2 methylamine tungstate şartına ve kristalleri vardır belirgin ve çatlaklar için önde gelen karbon yüzeyinde geniş kuvvetler uygularlar. Precipitates tek formda belirli bir PBS ve NS konsantrasyon aralığı ve daha uzun ( Şekil 3C) karşılaştır için örnek Klima tarafından kaçınılmalıdır. Panel 5D "kahve yüzük" sergileyen kullanılmış NS örnek damlacık çevre gösterir. Bu nicel, toplam numune analizine rahatsız ve EM kılavuz örnek uygulama sırasında çiğ noktası sıcaklığında tutmak ve sonra yavaş yavaş artan sıcaklığı kuru için ( yani, kurutma işlemi yavaşlatarak önlenebilir Şekil 3Abakın). Paneli 5E (apoferritin 20 mM HEPES, pH 7,0, klimalı 3 dk.) önce onlar Karbon film çekmek için adsorbe, koşul protein örnekleri için kullanılamayan % 2 uranyl asetat leke crosslinking faaliyet gösterir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig5.jpg"> Şekil 5: sistematik değişiklikleri ve eserler gözlenen ne zaman cryoWriter set-up ızgaralar NS - ve cryo-EM için hazırlamak için kullanıldı. A) sistematik vitreus buz kalınlığı varyasyon; cryo-EM için kılavuz hazırlık duruma getirilmesi. Çeşitli (8 K 12 K) tutmak inceltme zaman sabit DP sahneyi mahsup sıcaklığını yapıldı (1 s). Oklar örnek katman çevre gösterir. B) tuz etkileri; çok yüksek oranda konsantre, yani, inceltme adım çok uzundu. İlave bir 2 x büyütme belirtilen bölgenin gösteriyor. C) tuz PBS arabellek heavy metal tuzları huzurunda oluşturduğu precipitates. PBS arabellek içeren örnekleri örnekleri diğer arabelleklerindeki daha uzun süre şartına gerekir. PBS arabellek örnek olmadan % 2 methylamine tungstate 3 dakika içinde burada, diğer örnek arabellek tipik bir süre şartına. Karbon film ince destek kurutma işlemi sırasında hareket precipitates güçlü kuvvetlerden nedeniyle en büyük olasılıkla belgili tanımlık çatlamak unutmayın. D) 'Kahve ring' etkisi. E) 3 dk. Uranyl iyonları önemli crosslinking faaliyet ve apoferritin sergilemek için % 2 uranyl asetat şartına Apoferritin formu büyük toplamları kümeleri. Ölçek çubukları: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 200 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Küçük bir bölümü ve hacimli cryoWriter kurulumu kullanarak EM kılavuz hazırlanması için gerekli yeni deneyler türleri sağlar. Örneğin, tek bir hücre Toplam içeriği toplanan ve NS - ve cryo-EM için hazırlanmış. Yordamı Şekil 6'Abelirtilir. Yapışık, ökaryotik hücre (HEK 293) eşzamanlı Elektroporasyon ve örnek aspirasyon (Panel 6A)25tarafından lysed. 3 toplam hacmi nL emişli, hangi lysate hücresi ve diğer işlemler microcapillary korunur. NS-EM Panel 6B gösterildiği için hücre kültürü çalışmalarının orta PBS arabellek (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) hücre lizis önce alışverişinde. Hücre içeriğini 3'te Aspire nL arabelleği ve NS bir rezervuar Şekil 1' deC için 10 dk. sonra gösterildiği gibi şartına, 5 nL seviyesini bir NS-EM kılavuz sürekli Karbon film reçete. Bireysel proteinler, Örneğin, ipliksi aktin ve zar düzeltme ekleri bağlı proteinler ile görüntünün içinde kabul edilebilir. Cryo-EM, Şekil6 Cgösterildiği için 3 hacmi nL Tarih reçete delikli karbon EM kılavuz sıvı kaldırmak için yeniden aspirasyon olmadan. Oluşan örnek nispeten kalın film kapsamlı vitrifikasyon önce inceltilerek. Bunu yapmak için DP kademeli sıcaklık yavaş yavaş, çiğ noktası sıcaklığında başlayan yükseltilmiştir. Önceden belirtilen bir eşik 'çekme ve dalma' mekanizması ve örnek Vitrifiye (için Ayrıntılar bkz: Arnold, et al. tetikleyen ulaşıldı kadar inceltme işlemi gerçek zamanlı sensör sistemi tarafından izlenen yapıldı. 26). membran yapılar ve proteinler resimdeki tanıdı.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig6.jpg"> Şekil 6: tek hücre görsel proteomik cryoWriter kurulumu kullanarak. A) tek bir yapisan ökaryotik hücre lizis. Hücre (1, yeşil) bir functionalized, ITO (kırmızı) kaplı cam-slayt (2) içinde bir minyatür petri kabına (3)25üzerinde büyüyor. ITO katman elektriksel olarak topraklanmış olduğunu. Hücre platin ile kaplı (4), microcapillary tarafından yaklaştı. Bir ilk ozmotik şoku (değil gösterilir) bir dizi elektrik ve lysate hücre aspirasyon sırasında sarf kesme kuvvetleri tarafından gerçekleştirilen lizis kolaylaştırmak için verilir. İşlem tarafından ışık mikroskobu izlenebilir; mikroskop objektif lens belirtilen (5) ' dir. Ayrıntılı bilgi için bkz: bizim önceki iş24,25. B) NS-EM görüntüsünü lysate bir bireysel HEK 293 hücreden. İpliksi aktin ve membran yamalar bağlı proteinler ile görülebilir. Arnold, et al.24 adapte paneli (excerpted malzeme ilgili ilave izinleri yönetmen için ACS). C) Cryo-EM görüntüsünü lysate bir bireysel HEK 293 hücreden. İlave bir 2 x büyütme ile ilişkili proteinler tipik membran yapılar görünür nerede belirtilen bölge gösterir. Paneli C adapte Arnold, et al. 26 ölçek çubukları: B, 50 nm; C, 80 nm. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...