Name: crispr-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer at JoVE.com

हम तकनीकी सहायता के लिए लौरा Sieber, अंना Neuerburg, Yassin हरिँ, और पेट्रा Schroeter की सराहना करते हैं । हम डीआरएस को भी धन्यवाद देते हैं । DKFZ में पशु प्रयोगों के लिए सहायक सहायता के लिए Reifenberg, के. डेल और पी Prückl; इमेजिंग कोर की सुविधाएं DKFZ और कार्ल जीस इमेजिंग केंद्र के DKFZ में फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए । यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था, 4472/1-1 KA (to डी.) ।

पशु कल्याण विनियमों के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए गए थे और इन्हें उत्तरदायी प्राधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया है (Regierungspräsidium कार्ल्सृहे, अनुमोदन संख्या: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14, और G133/
१. उत्पन्न pU6-sgRNA-Cbh-Cre Pl...

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	<li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li><li>Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CRISPR/Cas9-mediated+tumour+suppressor+disruption+enables+versatile+brain+tumour+modelling.">Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling.</a> Nat Commun. 6, 7391 (2015).</li><li>Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+and+transforming+neocortical+progenitors+by+CRISPR/Cas9+gene+targeting+and+piggyBac+transposase+lineage+labeling.">Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling.</a> Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons:+involvement+of+ventricle-directed,+radial+fibre-associated+migration.">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).</li><li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation.">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).</li><li>Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+BarH1+confers+commissural+neuron+identity+on+dorsal+cells+in+the+spinal+cord.">Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord.</a> Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).</li><li>Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+expression+in+postmitotic+neurons+by+an+in+vivo+electroporation-based+tetracycline+system.">Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system.</a> J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).</li><li>Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+MYC-driven+medulloblastoma+models+from+multiple+embryonic+cerebellar+cells.">Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells.</a> Oncogene. , (2017).</li><li>Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chd7+is+indispensable+for+mammalian+brain+development+through+activation+of+a+neuronal+differentiation+programme.">Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme.</a> Nat Commun. 8, 14758 (2017).</li><li>Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA.">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355 (2013).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303 (2016).</li><li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development.">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).</li></ol>

exo utero electroporation का प्रयोग, हम पहले सिरना की सूचना दी है-Atoh1 के एक प्रारंभिक चरण में vivo कार्यात्मक विश्लेषण में अनुमस्तिष्क granules सेल भेदभाव8के आधार पर । गर्भाशय की दीवार के बाहर भ्रूण के सिरना कमजो...

मस्तिष्क रोगों सबसे भयानक नश्वर रोगों में से एक हैं । वे अक्सर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और बाद में dysregulation से परिणाम । मस्तिष्क रोगों के आणविक तंत्र को समझने के लिए, कभी मानव रोगियों के जीनोम को समझने के लिए स्थाई प्रयासों संभावित करणीय जीन की एक संख्या की खोज की है । अब तक, germline आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल vivo लाभ में समारोह के लिए उपयोग किया गया है (गोफ) और नुकसान की-समारोह (LOF) ऐसे उंमीदवार जीन का विश्लेषण । कार्यात्मक सत्यापन अध्ययन के त्वरित विकास के कारण, एक और अधिक व्यवहार्य और व्यावहारिक जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए vivo जीन परख प्रणाली में लचीला वांछनीय है ।
vivo electroporation-आधारित जीन अंतरण प्रणाली में विकासशील माउस मस्तिष्क के लिए एक के आवेदन इस प्रयोजन के लिए उपयुक्त है । वास्तव में, कई अध्ययनों utero electroporation में उपयोग कर अपनी क्षमता के लिए विकासशील मस्तिष्क1,2,3में कार्यात्मक विश्लेषण आचरण दिखाया है । दरअसल, इस तरह के सेरेब्रल प्रांतस्था4के रूप में माउस मस्तिष्क, के कई क्षेत्रों, रेटिना5, diencephalon6, hindbrain7, सेरिबैलम8, और रीढ़ की हड्डी9 दैहिक जीन डिलिवरी द्वारा लक्षित किया गया है दृष्टिकोण, अब तक ।
दरअसल, भ्रूण माउस दिमाग पर vivo electroporation में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति लंबे समय गोफ विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में transposon आधारित जीनोमिक एकीकरण प्रौद्योगिकियों के आगे सक्षम दीर्घकालिक और/या ब्याज की जीन की सशर्त अभिव्यक्ति10,11, जो के दौरान एक स्थानिक और लौकिक तरीके से काटना जीन समारोह के लिए लाभप्रद है विकास. गोफ विश्लेषण के विपरीत LOF विश्लेषण अधिक चुनौतीपूर्ण रहा है । जबकि siRNAs और shRNA के क्षणिक अभिकर्मक-ले plasmids प्रदर्शन किया गया था, जीन की LOF के दीर्घकालिक प्रभाव exogenously और न्यूक्लिक जैसे plasmids एसिड, शुरू की अंतिम गिरावट के कारण की गारंटी नहीं कर रहे हैं । हालांकि, CRISPR/Cas प्रौद्योगिकी LOF विश्लेषण में एक ब्रेक के माध्यम से प्रदान करता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग जीन (जैसे, GFP) या bioluminescent प्रोटीन (जैसे, जुगनू luciferase) गया है सह CRISPR के साथ transfected-Cas9 और sgRNAs-CRISPR-मध्यस्थता दैहिक उत्परिवर्तनों से अवगत कराया कोशिकाओं लेबल के लिए । फिर भी, इस दृष्टिकोण proliferating कोशिकाओं पर कार्यात्मक अध्ययन में सीमाएं हो सकती है, के बाद से exogenous मार्कर जीन पतला और लंबी अवधि के प्रसार के बाद नीचा दिखा रहे हैं । जबकि transfected कोशिकाओं और उनकी बेटी की कोशिकाओं को अपने जीनोम में CRISPR-प्रेरित उत्परिवर्तनों से गुजरना, उनके पैरों के निशान समय पर खो सकता है । इस प्रकार, आनुवंशिक लेबलिंग दृष्टिकोण इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए उपयुक्त होगा ।
हम हाल ही में अनुमस्तिष्क granules कोशिकाओं है कि उनके भेदभाव12के दौरान लंबी अवधि के प्रसार से गुजरना में एक CRISPR आधारित LOF विधि विकसित की है । transfected कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से लेबल करने के लिए, हमने Cre के साथ एक sgRNA ले जा रहे प्लाज्मिड का निर्माण किया और प्लाज्मिड cerebella-सीएजी-Rosa26-LSL-Cas9-P2A चूहों13 EGFP के utero में शुरू कर दिया । नियमित प्लाज्मिड वैक्टर EGFP एंकोडिंग के विपरीत, इस दृष्टिकोण सफलतापूर्वक transfected granules ंयूरॉन पुरोगामी (GNPs) और उनकी बेटी कोशिकाओं लेबल । इस विधि सामांय मस्तिष्क विकास और एक ट्यूमर की संभावना पृष्ठभूमि में proliferating कोशिकाओं में रुचि के जीन के समारोह vivo में समझ में महान समर्थन प्रदान करता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 488 Goat anti-Chicken</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 568 Donkey anti-Mouse</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10037</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 Donkey anti-Rabbit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21207</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647 Donkey anti-Rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase (FastAP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave band</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>150262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI (HF)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI (FastDigest)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FD1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Filter Paper (Whatman)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10347525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloth</td>
			<td>Tork</td>
			<td>530378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>biovision</td>
			<td>7903-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI (HF)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endofree Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (Bepanthen)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>81552983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10270-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F8148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent cell imager (ZOE)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15387311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary with Filament</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>ThermoLux</td>
			<td>463265 / -67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing software (ImageJ and Fiji)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AKP0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>TU061219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina LT Series III Caliper</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalt Suture Needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12050-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HIFI HOTSTART READY mix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Pointer</td>
			<td>Photonic</td>
			<td>PL3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid blocker pen</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamizol</td>
			<td>WDT</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microgrinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software ZEN</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound (Tissue-Tek)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p27 antibody</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>610241</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Roth</td>
			<td>335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG-EGxxFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>50716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides (SuperFrost)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10417002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for biostatistics (Prism 7)</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spitacid</td>
			<td>EcoLab</td>
			<td>3003840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors with blunt tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14072-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))</td>
			<td>SMI</td>
			<td>220340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors Blunt (11.5 cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14072-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP2B antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc13059</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5 %)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers w/5mm &#216; disk electrodes Platinum</td>
			<td>Xceltis GmbH</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>Dr&#228;gerwerk AG</td>
			<td>GS186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer

मस्तिष्क कुरूपता अक्सर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण होता है । रोगी-व्युत्पन्न ऊतकों में उत्परिवर्तनों का गूढ़ रूप से रोगों के संभावित करणीय कारकों की पहचान की है । रोग के विकास के लिए रूपांतरित जीन की एक शिथिलता के योगदान को मांय करने के लिए, पशु उत्परिवर्तनों ले मॉडल की पीढ़ी के एक स्पष्ट दृष्टिकोण है । जबकि germline आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) लोकप्रिय जैविक उपकरण और प्रदर्शन reproducible परिणाम हैं, यह समय और लागत से प्रतिबंधित है । इस बीच, गैर germline GEMMs अक्सर एक अधिक व्यावहारिक तरीके से जीन समारोह की खोज सक्षम करें । के बाद से कुछ मस्तिष्क रोगों (जैसे, ब्रेन ट्यूमर) दैहिक लेकिन नहीं germline उत्परिवर्तनों से परिणाम दिखाई देते हैं, गैर germline chimeric माउस मॉडल, जिसमें सामांय और असामांय कोशिकाओं के एक साथ रहना, रोग प्रासंगिक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है । इस अध्ययन में, हम सेरिबैलम में CRISPR की मध्यस्थता दैहिक उत्परिवर्तनों की प्रेरण के लिए एक विधि की रिपोर्ट । विशेष रूप से, हमने सशर्त दस्तक-चूहों का उपयोग किया, जिसमें Cas9 और GFP के जीनोम के Cre-मध्यस्थ पुनर्संयोजन के बाद सीएजी (सीएमवी बढ़ाने वाले/चिकन अ ß य-actin) प्रवर्तक द्वारा जीर्ण रूप से सक्रिय किए जाते हैं । स्व-डिजाइन एकल गाइड RNAs (sgRNAs) और Cre recombinase अनुक्रम, दोनों एक एकल प्लाज्मिड निर्माण में इनकोडिंग, अनुमस्तिष्क स्टेम में एक भ्रूण जनक utero में उपयोग कर चरण/electroporation कोशिकाओं में वितरित किया गया । नतीजतन, transfected कोशिकाओं और उनकी बेटी कोशिकाओं को हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), इस प्रकार आगे phenotypic विश्लेषण की सुविधा के साथ लेबल थे । इसलिए, इस विधि electroporation नहीं दिखा रहा है केवल भ्रूण अनुमस्तिष्क कोशिकाओं में जीन वितरण आधारित है, लेकिन यह भी एक उपंयास मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए CRISPR-मध्यस्थता हानि-समारोह phenotypes का आकलन का प्रस्ताव ।

vivo कार्यात्मक विश्लेषण में के लिए, यह कोशिकाओं में जो exogenous जीन (ओं) पेश किया गया है की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक मार्कर की अभिव्यक्ति, जैसे गैर-proliferating कोशिकाओं में GFP का पालन किया जा ?...

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CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

पारंपरिक नुकसान-की-समारोह जीन नॉकआउट जानवरों का उपयोग कर के अध्ययन अक्सर महंगा हो गया है और समय लेने वाली । Electroporation आधारित CRISPR-मध्यस्थता दैहिक mutagenesis vivo मेंजीन कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । यहां, हम सेरिबैलम के proliferating कोशिकाओं में नॉकआउट phenotypes का विश्लेषण करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट ।

Utero Electroporation में प्रयोग अनुमस्तिष्क दाना कोशिकाओं में समारोह विश्लेषण के CRISPR-मध्यस्थता हानि-आधारित जीन स्थानांतरण

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

पूर्व Vivo चिकी अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति और स्पैटियली Electroporation ग्रेन्युल सेल व्यापारियों की लक्षित

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

नुकसान और लाभ के समारोह दृष्टिकोण Preimplantation माउस भ्रूण के प्रारंभिक दिनों में सेल भाग्य अवधारक जांच

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

चिकन श्रवण अंग में जीन स्थानांतरण द्वारा<em&gt; Ovo में</em&gt; माइक्रो-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

में सक्रिय ERK के स्थानिक और लौकिक विश्लेषण<em&gt; सी। एलिगेंस</em&gt; जर्मलाइन

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

सेल वंश विश्लेषण और जीन समारोह अध्ययन ट्विन मौके MARCM का प्रयोग

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में संरचना-समारोह अध्ययन Recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज का उपयोग करना

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 और Laminin एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कंकाल मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं की पहचान

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...