Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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Nous tenons à remercier tous les membres précédents du laboratoire Bouchier-Hayes qui ont contribué au développement de cette technique. Ce travail a été financé en partie par hôpital pédiatrique pilote award un Texas enfants à LBH. Nous remercions Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas, États-Unis) pour obtenir l’autorisation d’inclure des données publiées en collaboration avec son équipe. Le développement des réactifs décrit a été soutenu par la cytométrie en flux et noyau de tri cellulaire au Baylor College of Medicine financée par les NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 et RRRNC S10RR024574) et l’assistance de Joel M. Sederstrom

1. préparation des cellules et Pétri
Remarque : Effectuez les étapes 1 à 3 dans une hotte à flux laminaire vitroplants. Porter des gants.
<ol><li>Si vous utilisez des plats en verre bas, enduire le verre avec la fibronectine. Passez à l’étape 1.2 Si vous utilisez des plats en plastique.<ol>
<li>Préparer une solution à 0,1 mg/mL de la fibronectine : Diluer 1 mL de 1 mg/mL de solution de la fibronectine dans 9 mL de solution 1 PBS X.</li>
		<li>Tapissez le fond de verre de chaque ...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Ce protocole traite de l’utilisation de fractionnement des protéines fluorescentes pour mesurer la proximité de caspases induite. Vénus de Split a été choisie pour cette technique car il est très lumineux, hautement photostable et le repliement est rapide 13. Ainsi, l’analyse de Vénus repliement à proximité de caspases induite peut fournir près des estimations en temps réel de la dynamique des interactions protéine caspase. Vénus est divisée en deux fragments légèrement superpo...

La famille de protéases de caspase est connue pour leur rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée 1. En raison de leur importance, déterminer quand, où et comment efficacement des caspases sont activés peut apporter un éclairage crucial sur les mécanismes de la caspase voies d’activation. Le protocole de base d’imagerie décrit ici permet la visualisation des premières étapes dans la cascade d’activation de la caspase. Cette technique tire parti des interactions dynamiques : la protéine cette activation de caspases en voiture.
Les caspases peuvent être divisés en deux groupes : les caspases initiateur (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 et -12) et les caspases bourreau (caspase-3, -6 et -7). Les caspases bourreau sont présents dans la cellule comme dimères préformés et sont activés par un clivage entre la grande et petite sous-unité 2. Lorsqu’il est activé, ils fendent de nombreuses protéines structurelles et réglementaires, aboutissant à l’apoptose 3. Les caspases initiateur sont les caspases premières pour être activé dans une voie généralement déclencher l’activation des caspases bourreau. Contrairement au bourreau caspases, initiateur caspases sont activés par dimérisation 4,5. Cette dimérisation est facilitée par le recrutement de monomères inactifs pour spécifique grand poids moléculaire complexes appelées plates-formes d’activation. Assemblée des plates-formes d’activation est régie par une série d’interactions de protéine : protéine spécifique. Ceux-ci sont médiés par des motifs d’interaction protéine conservée présents dans le proform de la caspase initiatrice et incluent le domaine mort (DD), le domaine effecteur de mort (DED) et la caspase recrutement domaine (carte) 6 (Figure 1 a). Plates-formes d’activation incluent généralement une protéine réceptrice et une protéine adaptatrice. Habituellement, le récepteur est activé lors de la liaison d’un ligand, induisant un changement conformationnel permettant l’oligomérisation de nombreuses molécules. Le receveur recrute alors soit la caspase directement ou les molécules d’adaptateur qui à son tour apportent la caspase au complexe. Ainsi, les nombreuses molécules de caspase entrent en proximité permettant une dimérisation. Ceci est connu comme le modèle de proximité induite par 7. Une fois que les mélanges, la caspase subit une autoprocessing, qui sert à stabiliser l’enzyme active 4,8. Par exemple, l’Assemblée de l’apoptosome Apaf1 est déclenchée par le cytochrome c, suite à sa sortie de la mitochondrie dans un processus appelé la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP). Apaf1 recrute à son tour caspase-9 grâce à une interaction qui est véhiculée par une carte présente dans les deux protéines 9. Résultat des interactions protéine similaire dans l’Assemblée de la mort CD95 induisant la signalisation complexe (disque) qui mène à l’activation de la caspase-8 ; le PIDDosome, qui peut activer la caspase-2 ; et divers complexes inflammasome qui initie l’activation de la caspase-1 10,11,12. Ainsi, initiateur caspases sont recrutés aux plates-formes d’activation spécifique par un mécanisme commun aboutissant à proximité induite et une dimérisation, sans laquelle activation ne se produira pas.
Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une analyse axée sur l’imagerie qui a été développée pour mesurer cette première étape de l’activation des caspases initiateur, ce qui permet une visualisation directe de la proximité de caspases induite par suite de plateforme d’activation Assemblée. Cette méthode tire parti des propriétés de la protéine fluorescente split Venus. Vénus est un plus brillant et plus version photostable de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui peut être séparé en deux fragments non fluorescent et légèrement superposées : l’extrémité N-terminale de Vénus (Venus N ou VN) et l’extrémité C-terminale de Vénus (Venus C ou VC). Ces fragments conservent la possibilité de replier et devient fluorescent lorsqu’à proximité 13. Chaque fragment de Vénus est fusionnée à la prodomain de la caspase, c'est-a-dire la portion minimale de la caspase qui se lie à la plateforme d’activation. Cela garantit que les caspases ne conservent pas l’activité enzymatique et par conséquent une analyse concomitante des événements en aval associés aux événements endogènes est possible. La Vénus des fragments repli quand les caspase prodomains sont recrutés à la plateforme d’activation et subissent une proximité induite. (Figure 1 b). La fluorescence de Vénus qui en résulte peut être utilisée avec précision et plus particulièrement surveiller la localisation subcellulaire, la cinétique et l’efficacité de l’Assemblée d’initiator caspase activation plates-formes dans des cellules individuelles. Données d’imagerie peuvent être acquises par microscopie confocale ou par microscopie de fluorescence standard et peut être adaptée à un certain nombre d’approches différentes de la microscopie, y compris : imagerie Time-lapse pour suivre l’activation de la caspase en temps réel ; imagerie à haute résolution pour des déterminations précises de localisation sous-cellulaire ; et la quantification de point de terminaison de l’efficacité de l’activation.
Cette technique a été développée afin d’étudier l’activation de la caspase-214. Tandis que la plate-forme d’activation de la caspase-2 est considérée comme le PIDDosome, composé du récepteur PIDD (induite par la p53 protéine avec un domaine de mort) et l’adaptateur RAIDD (protéines homologues RIP-associated ICH-1/CAD-3 avec un domaine de mort), Activation de caspase-2 PIDDosome-indépendant a été signalée. Ceci suggère que les plates-formes d’activation supplémentaire pour caspase-2 existent 15,16. Malgré ne connaissant pas les composants complètes de la plate-forme d’activation de la caspase-2, la caspase BiFC technique a laissé pour interrogatoire réussie des voies de signalisation caspase-2 au niveau moléculaire 14,17. Nous avons également adapté ce protocole pour les caspases inflammatoires (caspase-1, -4, -5 et -12) 18 et, en principe, la même approche devrait être suffisante pour analyser de la même façon chacun des caspases initiateur restants. Ce protocole pourrait de même être adapté pour étudier d’autres voies ont été dimérisation est un important signal activant. Par exemple, les protéines STAT sont activés par dimérisation après phosphorylation par Janus kinase (JAK) 19. Ainsi, le système de BiFC pourrait servir à visualiser pour activation STAT ainsi que plusieurs autres sentiers réglementés par des interactions de protéine dynamique. Le protocole suivant fournit des instructions détaillées pour la mise en place des journalistes dans les cellules, ainsi que des méthodologies d’analyse et d’acquisition d’images.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

La famille de caspase des protéases joue un rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée. Parmi ceux-ci, un sous-groupe appelé initiateur caspases sont les premiers à être activées dans ces voies. Ce groupe comprend caspase-2, -8 et -9, ainsi que les caspases inflammatoires, caspase-1, -4 et -5. Les caspases initiateur sont tous activés par dimérisation suivant l’embauche à des complexes multiprotéiques spécifiques appelées plates-formes d’activation. Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une approche axée sur l’imagerie où se sépare des protéines fluorescentes fondues à détonateur caspases sont utilisées pour visualiser le recrutement des caspases initiateur à leurs plates-formes d’activation et de la proximité induite. Cette fluorescence fournit une lecture de l’un des premiers étapes requises pour l’activation des caspases initiateur. À l’aide d’un certain nombre de différentes approches axées sur la microscopie, cette technique peut fournir des données quantitatives sur l’efficacité de l’activation de la caspase sur une échelle de la population ainsi que la cinétique de l’activation de la caspase, la taille et le nombre d’activation des caspases complexes sur une base par cellule.

Un exemple de caspase-2 BiFC induite par l’altération de l’ADN est illustré à la Figure 3. Camptothécine, une topoisomérase I inhibiteur, a été utilisé pour induire l’activation de l’ADN des dommages et de la caspase-2. Le mCherry de la protéine fluorescente rouge a été utilisé comme reporter pour montrer que les cellules expriment la sonde BiFC et pour aider à visualiser le nombre total de cellules. Fluorescence de Vénus est affiché en...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

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A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Mesure de l’activité des caspases à l’aide d’un dosage fluorométrique ou d’une cytométrie en flux

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...