Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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Wir möchten alle bisherigen Mitglieder des Bouchier-Hayes Lab zu würdigen, die für die Entwicklung dieser Technik beigetragen. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Texas Children Hospital Pediatric Pilot Award, LBH finanziert. Wir danken für die Erlaubnis, in Zusammenarbeit mit ihrem Team veröffentlichte Daten gehören Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas). Die Entwicklung der beschriebenen Reagenzien wurde durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 und NCRR S10RR024574) und die Unterstützung des Joel M. Sederstrom

1. Vorbereitung der Zellen und Kultur Gerichte
Hinweis: Führen Sie Schritte 1-3 in einer Gewebekultur Laminar-Flow-Haube. Tragen Sie Handschuhe.
<ol><li>Wenn unten Glasschalen, bestreichen Sie das Glas mit Fibronektin. Fahren Sie mit Schritt 1.2, wenn Kunststoffgeschirr verwenden.<ol>
<li>Machen Sie eine 0,1 mg/mL Lösung von Fibronektin: 1 mL 1 mg/mL Fibronektin Lösung in 9 mL 1 X PBS verdünnen.</li>
		<li>Bedecken Sie den Glasboden von jedem Bohrloch mit 0,5-1 mL Fibronektin und 1-5 min...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Split fluoreszierende Proteine, Caspase induzierte Nähe zu messen. Split-Venus wurde für diese Technik gewählt, weil es sehr hell ist, photostabil und die Umfaltung ist sehr schnell 13. So kann die Analyse der Venus Umfaltung auf Caspase induzierte Nähe in der Nähe von Echtzeit-Schätzungen von Caspase Proteindynamik Interaktion bieten. Venus ist aufgeteilt in zwei leicht überlappende Fragmente, die N-Terminus von Venus (Venus-N oder VN) bestehe...

Die Caspase-Protease-Familie sind bekannt für ihre kritischen Rollen in Apoptose und angeborene Immunität 1. Wegen ihrer Bedeutung bestimmen, wann, wo und wie effizient bestimmte Caspasen aktiviert bieten entscheidende Einblicke in die Mechanismen der Caspase Aktivierung Wege. Die Bildgebung basierende Protokoll hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der ersten Schritte in der Caspase-Kaskade Aktivierung. Diese Technik nutzt die dynamische Protein: Protein-Interaktionen, dass Laufwerk Caspase-Aktivierung.
Die Caspasen können in zwei Gruppen unterteilt werden: der Initiator Caspasen (Caspase-1, -2,-4-5, -8,-9,-10 und-12) und der Henker Caspasen (Caspase-3,-6 und-7). Der Henker Caspasen befinden sich in der Zelle als vorgeformte Dimere und werden durch Spaltung zwischen den großen und kleinen Untereinheit 2aktiviert. Wenn aktiviert, Spalten sie zahlreiche strukturelle und regulatorische Proteine wiederum Apoptose 3. Der Initiator Caspasen sind die ersten Caspasen in einen Pfad aktiviert werden und in der Regel die Aktivierung der Henker Caspasen auslösen. Im Gegensatz zum Henker Caspasen werden durch Dimerisierung 4,5Initiator Caspasen aktiviert. Diese Dimerisierung wird durch Rekrutierung von inaktiven Monomeren zu bestimmten hohem Molekulargewicht komplexe bekannt als Aktivierung Plattformen erleichtert. Montage der Aktivierung Plattformen unterliegt einer Reihe von spezifischen Protein: Protein-Interaktionen. Diese sind vermittelt durch konserviertes Protein Interaktion Motive in der proform Initiator Caspase vorhanden und gehören der Tod Domäne (DD), Tod-Effektor-Domäne (DED) und Caspase Recruitment Domain (CARD) 6 (Abb. 1A). Aktivierung-Plattformen umfassen in der Regel einen Rezeptor und eine Adapter-Protein. Der Rezeptor wird in der Regel bei der Bindung eines Liganden induziert eine Konformationsänderung, die die Oligomerisierung von zahlreichen Molekülen ermöglicht aktiviert. Der Rezeptor rekrutiert dann entweder die Caspase direkt oder Adapter-Moleküle, die wiederum die Caspase in die Anlage bringen. So kommen zahlreiche Caspase-Moleküle in der Nähe schönem Dimerisierung. Dies wird als induzierte Nähe Modell 7bezeichnet. Sobald dimerized, erfährt die Caspase Autoprocessing, die dazu dient, das aktive Enzym 4,8zu stabilisieren. Montage von Apaf1 Apoptosome wird z. B. durch Cytochrom c nach seiner Entlassung aus den Mitochondrien in einem Prozess namens mitochondrialen Außenmembran Permeabilisierung (MOMP) ausgelöst. Apaf1 Rekruten wiederum Caspase-9 durch eine Interaktion, die durch eine Karte in beiden Proteine 9vermittelt wird. Ähnlich wie Protein-Interaktionen führen in der Montage von CD95 Tod induzieren, komplexen Signalisierung (DISC), der zur Aktivierung der Caspase-8 führt; die PIDDosome, die Caspase-2 aktivieren können; und verschiedenen Inflammasome-komplexe, die Aktivierung der Caspase-1 10,11,12zu initiieren. So, sind Initiator Caspasen, spezifische Aktivierung Plattformen rekrutiert, durch einen gemeinsamen Mechanismus, wodurch induzierte Nähe und Dimerisierung, ohne die Aktivierung nicht erfolgt.
Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Test, der entwickelt wurde, um diesen ersten Schritt bei der Aktivierung von Initiator Caspasen Messen ermöglicht direkten Visualisierung der Caspase induzierte Nähe nach Aktivierung Plattform Montage. Diese Methode nutzt die Eigenschaften des geteilten fluoreszierenden Proteins Venus. Venus ist ein heller und mehr photostabilen Version gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), die in zwei nicht-fluoreszierende und leicht überlappende Fragmente unterteilt werden kann: der N-Terminus von Venus (Venus N oder VN) und dem C-Terminus der Venus (Venus C oder VC). Diese Fragmente behalten die Fähigkeit zu entfalten und fluoreszierende wenn in unmittelbarer Nähe 13. Jedes Fragment Venus ist mit der prodomain der Caspase ist an der Aktivierung Plattform bindet den minimalen Teil der Caspase verschmolzen. Dadurch behalten die Caspasen nicht enzymatische Aktivität und daher ist die gleichzeitige Analyse der nachgeschalteten Ereignisse im Zusammenhang mit endogenen Veranstaltungen möglich. Die Venus Fragmente Zurückfaltung, wenn die Caspase-Prodomains zur Aktivierung Plattform rekrutiert und induzierte Nähe zu unterziehen. (Abbildung 1 b). Die daraus resultierende Venus Fluoreszenz lässt sich präzise und speziell die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Effizienz der Versammlung der Initiator Caspase Aktivierung Plattformen in einzelnen Zellen überwachen. Bilddaten können erworben werden, durch konfokale Mikroskopie oder standard Fluoreszenz-Mikroskopie und kann auf eine Reihe von verschiedenen Mikroskopie Ansätzen einschließlich angepasst werden: Zeitraffer imaging zu verfolgen Caspase-Aktivierung in Echtzeit; hochauflösende Bildgebung für die präzise Bestimmung der subzellulären Lokalisierung; und Endpunkt Quantifizierung der Effizienz der Aktivierung.
Diese Technik wurde zuerst entwickelt, um die Aktivierung von Caspase-214zu untersuchen. Während die Aktivierung Plattform für Caspase-2 angenommen wird, die PIDDosome, bestehend aus den Rezeptor PIDD (p53-induzierte Protein mit einer Domäne Tod) und der Adapter RAIDD (RIP-assoziierte ICH-1/CAD-3 homologen Protein mit einer Domäne Tod), PIDDosome-unabhängige Caspase-2 Aktivierung wurde berichtet. Dies deutet darauf hin, dass zusätzliche Aktivierung Plattformen für Caspase-2 15,16vorhanden. Trotz nicht zu wissen, die volle Komponenten der Aktivierung der Caspase-2-Plattform, hat die Caspase BiFC Technik für erfolgreiche Befragung der Caspase-2 Signalwege auf der molekularen Ebene 14,17erlaubt. Wir haben dieses Protokoll für die inflammatorischen Caspasen (Caspase-1,-4 und-5-12) auch erfolgreich angepasst 18 und im Prinzip der gleiche Ansatz sollte ausreichen, ebenso jede der verbleibenden Initiator Caspasen zu analysieren. Dieses Protokoll kann entsprechend angepasst werden, andere Wege zu untersuchen wurden Dimerisierung ist eine wichtige aktivierende Zeichen. STAT-Proteine werden zum Beispiel durch Dimerisierung nach Phosphorylierung von Janus Kinase (JAK) 19aktiviert. So konnte das BiFC System einsetzbar für STAT Aktivierung sowie viele andere Wege, die durch dynamische Proteininteraktionen geregelt zu visualisieren. Das folgende Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Einführung der Reporter in Zellen sowie Methoden zur Bildaufnahme und Analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

Die Familie Caspase Proteasen spielen eine entscheidende Rolle in Apoptose und angeborene Immunität. Unter diesen eine Untergruppe, bekannt als Initiator Caspasen sind die ersten, die in diesen Bahnen aktiviert werden. Zu dieser Gruppe gehören Caspase-2-9-8, sowie die inflammatorischen Caspasen, Caspase-1,-4 und-5. Der Initiator Caspasen sind alle durch Dimerisierung nach der Einstellung zu bestimmten Multi-komplexe genannt Aktivierung Plattformen aktiviert. Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC) ist ein Imaging-basierte Ansatz dem geteilt fluoreszierende Proteine fusioniert, Initiator Caspasen verwendet, um die Rekrutierung von Initiator Caspasen zu ihrer Aktivierung-Plattformen und die daraus resultierenden visualisieren induzierte Nähe. Diese Fluoreszenz bietet eine Anzeige von einer der frühesten für Initiator Caspase Aktivierung erforderlichen Schritte. Mit einer Reihe von verschiedenen Mikroskopie-basierte Ansätze, bieten diese Technik quantitative Daten über die Effizienz der Caspase-Aktivierung auf einem Niveau der Bevölkerung sowie die Kinetik der Caspase-Aktivierung und die Größe und Anzahl der Aktivierung von caspase komplexe pro Zelle.

Ein Beispiel von Caspase-2 BiFC durch DNA-Schäden induzierte ist in Abbildung 3dargestellt. Camptothecin, eine Topoisomerase ich Inhibitor, wurde verwendet, um DNA-Schäden und Caspase-2 Aktivierung induzieren. Das rot fluoreszierende Protein mCherry diente als Reporter zu zeigen, dass die Zellen die BiFC Sonde auszudrücken und zu helfen, die Gesamtzahl der Zellen zu visualisieren. Venus Fluoreszenz ist grün dargestellt und die großen Puncta stellen Caspa...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Dieses Protokoll beschreibt Caspase bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC); eine Imaging-basierte Methode, die verwendet werden, um induzierte Nähe der Initiator Caspasen, zu visualisieren, das ist der erste Schritt in ihre Aktivierung.

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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