Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

ברצוננו להודות כל הקודם חברי המעבדה Bouchier-הייז שתרמו להתפתחות של טכניקה זו. עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרס טייס בילדים בבית החולים לילדים טקסס אנא צרו קשר. אנו מודים צ'אנדרה Joya (MD אנדרסון, יוסטון, טקסס) על הרשאה לכלול נתונים לאור בשיתוף עם הצוות שלה. התפתחות ריאגנטים תיאר נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 ו NCRR S10RR024574), הסיוע של ג'ואל מ Sederstrom

1. הכנת התאים ומנות תרבות
הערה: בצע את שלבים 1-3 בשכונה זרימה שכבתית תרביות רקמה. ללבוש כפפות.
<ol><li>אם באמצעות כלי הזכוכית התחתונה, מעיל הזכוכית עם fibronectin. לדלג על שלב 1.2 אם משתמש מנות פלסטיק.<ol>
<li>להפוך את פתרון 0.1 מ"ג/מ"ל של fibronectin: למהול 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל fibronectin פתרון 9 מ ל 1 X PBS.</li>
		<li>?...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

פרוטוקול זה דן השימוש של חלבונים פלורסנט מפוצל כדי למדוד את קספאז המושרה קרבה. פיצול ונוס נבחרה עבור טכניקה זו כי הוא בהיר מאוד, מאוד photostable, את refolding הוא מהיר 13. לפיכך, הניתוח של ונוס refolding על קרבה קספאז המושרה יכול לספק קרוב אומדנים בזמן אמת של קספאז חלבון אינטראקציה דינמיקה. ונ...

משפחת פרוטאז קספאז ידועים שלהם תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות 1. בשל חשיבותם, קביעה מתי, היכן, באיזו מידת יעילות caspases ספציפי מופעלים יכול לספק תובנות מנגנוני קספאז מכריע הפעלה מסלולים. פרוטוקול מבוסס הדמיה המתוארים כאן מאפשר את החזיית בשלבים המוקדמים קספאז הפעלת המפל. טכניקה זו לוקח את היתרונות של אינטראקציות חלבון דינמי: הפעלת קספאז באותו כונן.
Caspases ניתן לחלק לשתי קבוצות: caspases המאתחל (קספאז-1,-2,-4,-5, -8,-9,-10 ו-12), את caspases התליין (קספאז-3,-6 ו-7). Caspases התליין נמצאים בתא כמו הדימרים preformed, מופעלים על-ידי פצילות בין יחידת משנה קטנים וגדולים 2. כשהוא מופעל, הם קליב חלבונים מבניים ותקינה רבים וכתוצאה מכך אפופטוזיס 3. Caspases המאתחל הן caspases הראשונה תופעל ב מסלול, בדרך כלל להפעיל את ההפעלה של caspases התליין. בניגוד caspases התליין, יוזם caspases מופעלים על ידי 4,dimerization5. Dimerization הזה הוא הקל על ידי גיוס של מונומרים לא פעיל כדי מתחמי משקל מולקולרי גדול ספציפי ידוע as פלטפורמות הפעלה. הרכבה של פלטפורמות הפעלה נשלטת על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון: חלבון ספציפי. אלה מתווכת על ידי מוטיבים אינטראקציית חלבון שנשמרת נוכח proform של קספאז המאתחל, כוללים את תחום המוות (DD), תחום אפקטור מוות (DED) קספאז גיוס לתחום (כרטיס) 6 (איור 1 א'). פלטפורמות הפעלה כוללים בדרך כלל חלבון קולטן וחלבון של מתאם. הקולטן מופעל בדרך כלל בעת איגוד של ליגנד, וגורם לשינוי הסתגלותי המאפשר oligomerization של מולקולות רבות. הקולטן ואז גם מגייס את קספאז ישירות או מולקולות מתאם בתורו להביא את קספאז המתחם. לפיכך, מולקולות קספאז רבים להיכנס בסמיכות המתיר dimerization. זה נקרא את המודל של קרבה המושרה 7. ברגע dimerized, קספאז עובר עיבוד אוטומטי, אשר משמש כדי לייצב את האנזים פעיל 4,8. לדוגמה, הרכבה של apoptosome Apaf1 המופעלת על-ידי ציטוכרום c בעקבות השקתו של המיטוכונדריה בתהליך הקרוי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי permeabilization (MOMP). Apaf1 מגייס בתורו קספאז-9 על-ידי אינטראקציה זה מתווך על ידי כרטיס נוכחות שני חלבונים 9. אינטראקציות חלבון דומה לגרום ההרכבה של CD95 המוות גרימת איתות מורכבים (דיסק) שמוביל הפעלה קספאז-8; PIDDosome, אשר ניתן להפעיל קספאז-2; מתחמי inflammasome שונים כי ליזום הפעלה קספאז-1 10,11,12. לפיכך, יוזם caspases מגויסים כדי פלטפורמות הפעלה ספציפית ע י מנגנון משותף וכתוצאה מכך מושרה הקרבה, dimerization, אשר בלעדיו לא יתרחש הפעלה.
קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) הוא assay מבוססת הדמיה שפותחה כדי למדוד את זה הצעד הראשון בהפעלת caspases היוזם, ומאפשר פריט חזותי ישיר של הגיינה קספאז הנגרמת בעקבות הפעלת פלטפורמה הרכבה. שיטה זו מנצלת המאפיינים של החלבון הניאון פיצול ונוס. ונוס היא של יותר ויותר בהיר יותר photostable גירסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי ניתן להפריד לשני מקטעים שאינם-פלורסנט, מעט חופפים: N-הסופית של נוגה (ונוס N או VN) ו- C-הסופית של נוגה (ונוס C או VC). קטעים אלה שומרים על היכולת לקפל ולהפוך פלורסנט כאשר אתה נמצא בסמיכות 13. כל שבר ונוס היא דבוקה prodomain של קספאז, המהווה החלק מינימלי של קספאז המאגד פלטפורמת הפעלה. פעולה זו מבטיחה כי caspases אינם שומרים על פעילות אנזימטיות, לכן ניתוח בו-זמניות של הזרם באירועים המשויכים אירועים אנדוגני הוא אפשרי. . ונוס קטעים לקפל כאשר prodomains קספאז גייסו פלטפורמת הפעלה ומבצעת קרבה המושרה. (איור 1B). קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך ונוס ניתן לעקוב במדויק, במיוחד ההתאמה subcellular, קינטיקה של, ואת היעילות של הרכבה של יוזם קספאז פלטפורמות הפעלה של תאים בודדים. הדמיה נתונים ניתן לרכוש על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או על-ידי קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ, ניתן להתאים מספר גישות מיקרוסקופיה שונים כולל: הדמיה בצילום מואץ כדי לעקוב אחר קספאז הפעלה בזמן אמת; הדמיה ברזולוציה גבוהה עבור מדויק ועיונם לוקליזציה subcellular; נקודת הקצה כימות של היעילות של ההפעלה.
שיטה זו פותחה לראשונה כדי לחקור את ההפעלה של קספאז-214. בעוד הפלטפורמה הפעלה קספאז-2 נחשב להיות PIDDosome, המורכב של הקולטן PIDD (חלבון p53-induced עם תחום המוות), את מתאם RAIDD (RIP-הקשורים ICH-1/CAD-3 הומולוגי חלבון עם תחום המוות), דווח PIDDosome תלויית הפעלה קספאז-2. הדבר מצביע על כי פלטפורמות הפעלה נוספים קספאז-2 קיימים 15,16. למרות הידיעה הרכיבים המלאה של פלטפורמת הפעלה קספאז-2, אפשרה קספאז טכניקה BiFC לחקירה מוצלחת של המסלולים איתות קספאז-2 של ה ברמה המולקולרית 14,17. אנחנו גם בהצלחה הסתגלו פרוטוקול זה עבור caspases דלקתיות (קספאז-1, ארבע,-5 ו-12) 18 , בעקרון, אותה גישה צריך להספיק באופן דומה לנתח את כל caspases יוזם הנותרים. פרוטוקול זה דומה יכול להיות מותאם כדי לחקור את המסלולים אחרות היו dimerization הוא אות הפעלת מרכזי. לדוגמה, חלבונים STAT מופעלים על ידי dimerization בעקבות זרחון יאנוס קינאז (JAK) 19. לפיכך, מערכת BiFC יכול לשמש כדי להמחיש הפעלת STAT, כמו גם משעולים רבים אחרים מוסדר על ידי אינטראקציות חלבון דינמי. פרוטוקול הבאים מספק הוראות מפורטות על כניסתה של הכתבים לתוך תאים, כמו גם שיטות עבור ייבוא תמונות וניתוח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

משפחת קספאז של פרוטאזות ממלאים תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות. בין אלה, קבוצת משנה המכונה יוזם caspases הם הראשונים להיות מופעל בתוך המסלולים הללו. קבוצה זו כוללת קספאז-2-8, ו-9, וכן את caspases דלקתיות, קספאז-1, ארבע, ו-5. Caspases המאתחל כולם מופעלים על ידי dimerization בעקבות גיוס קומפלקסים multiprotein ספציפי שנקרא הפעלת פלטפורמות. קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) היא גישה מבוססת הדמיה איפה לפצל חלבונים פלורסנט דבוקה יוזם caspases משמשים כדי להמחיש את גיוס יוזם caspases פלטפורמות הפעלה שלהם, וכתוצאה מכך הקרבה המושרה. קרינה פלואורסצנטית הזה מספק את הבדיקה של אחד השלבים המוקדמים הנדרשים להפעלת קספאז יוזם. שימוש במספר גישות שונות מבוסס מיקרוסקופיה, טכניקה זו יכולה לספק נתונים כמותיים על היעילות של קספאז הפעלה ברמת האוכלוסייה, כמו גם את קינטיקה של קספאז ההפעלה ואת גודל מספר קספאז מפעיל מתחמי על בסיס לכל תא.

דוגמה של קספאז-2 BiFC הנגרם על ידי נזק לדנ א מוצג באיור3. Camptothecin, טופואיזומראז אני מעכב, שימש לזירוז ההפעלה נזק וקספאז-2 ה-DNA. MCherry חלבון פלואורסצנטי אדום שימש ככתב להראות כי התאים להביע את המכשיר BiFC שיעזרו להמחיש את המספר הכולל של תאים. קרינה פלואורסצנטית וונוס...

Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

השלמת פעילות התרסיס על ידי מתחם גלקטין-3 - U1 snRNP על חרוזים

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...