Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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Vorremmo ringraziare tutti i membri precedenti del laboratorio Bouchier-Hayes, che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal ospedale pediatrico pilota premio Texas bambini a LBH. Ringraziamo la Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) per il permesso di includere i dati pubblicati in collaborazione con la sua squadra. Lo sviluppo dei reagenti descritto è stato sostenuto dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom

1. preparazione delle cellule e piastre di coltura
Nota: Eseguire i passaggi 1-3 in cappa a flusso laminare di coltura del tessuto. Indossare i guanti.
<ol><li>Se utilizza piatti di fondo di vetro, ricoprire il vetro con fibronectina. Andare al passaggio 1.2 se utilizza piatti di plastica.<ol>
<li>Fare una soluzione di 0,1 mg/mL di fibronectina: diluire 1 mL di soluzione di fibronectina 1 mg/mL in 9 mL di 1X PBS.</li>
		<li>Coprire il fondo di vetro di ciascun pozzetto con 0,5-1 mL di fibron...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Questo protocollo viene illustrato l'utilizzo di proteine fluorescenti di Spalato per misurare caspasi indotta prossimità. Venus di Spalato è stato scelto per questa tecnica perché è molto luminoso, altamente fotostabili e il ripiegamento è veloce 13. Così, l'analisi di Venere ripiegamento su caspasi indotta prossimità può fornire vicino le valutazioni in tempo reale delle dinamiche di interazione della proteina caspasi. Venus è diviso in due frammenti leggermente sovrapposti, il capoline...

La famiglia di proteasi caspasi è noti per i loro ruoli critici nell'apoptosi e immunita ' 1. A causa della loro importanza, determinare quando, dove e quanto efficientemente caspases specifici vengono attivati può fornire le comprensioni cruciale nei meccanismi della caspasi vie di attivazione. Il protocollo base imaging qui descritto consente la visualizzazione dei primi passi nella cascata di attivazione di caspasi. Questa tecnica sfrutta le interazioni dinamiche della proteina: l'attivazione di caspase che in auto.
I caspases possono essere divisi in due gruppi: i caspases iniziatore (caspasi-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e i caspases boia (caspase-3, -6 e -7). I caspases boia sono presenti nella cellula come dimeri preformati e vengono attivati tramite fenditura tra le grandi e piccole subunità 2. Quando attivato, essi fendere numerose proteine strutturali e regolatorie conseguente apoptosi 3. I caspases iniziatore sono i caspases primi di essere attivato in un percorso e attivano l'attivazione delle caspasi boia. A differenza di caspases boia, initiator caspases sono attivati da dimerizzazione 4,5. La dimerizzazione è facilitata dal reclutamento di monomeri inattivi per specifiche grande peso molecolare complessi noti come piattaforme di attivazione. Montaggio di piattaforme di attivazione è regolato da una serie di interazioni specifiche: proteina. Questi sono mediati dai motivi di interazione della proteina conservata presente nel proform di caspase l'iniziatore e includere il dominio di morte (DD), dominio effector di morte (DED) e caspase recruitment domain (CARD) 6 (Figura 1A). Piattaforme di attivazione in genere comprendono una proteina recettore e una proteina dell'adattatore. Il recettore è solitamente attivato al momento di legame di un ligando, che induce un cambiamento conformazionale che permette per l'oligomerizzazione di numerose molecole. Il recettore quindi neanche reclute il caspase direttamente o molecole di adattatore che a sua volta portano il caspase al complesso. Così, numerose molecole di caspase mai avvicinare permettendo la dimerizzazione. Questo è noto come la prossimità indotta modello 7. Una volta dimerized, le caspasi subisce autoprocessing, che serve a stabilizzare l'enzima attivo 4,8. Ad esempio, Assemblea dell'apoptosoma Apaf1 viene attivato dal citocromo c dopo il suo rilascio dai mitocondri in un processo chiamato permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP). Apaf1 reclute a sua volta caspase-9 attraverso un'interazione che è mediata da una carta presente in sia proteine 9. Risultato di interazioni proteina simile all'Assemblea della CD95 morte inducendo complessi di segnalazione (disco) che conduce all'attivazione di caspasi-8; il PIDDosome, che può attivare le caspasi-2; e vari complessi inflammasome che avviano l'attivazione di caspasi-1 10,11,12. Così, initiator caspases sono reclutati per piattaforme di attivazione specifico da un meccanismo comune conseguente indotto vicinanza e dimerizzazione, senza la quale non si verificherà l'attivazione.
Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un test basato su formazione immagine che è stato sviluppato per misurare questo primo passo nell'attivazione delle caspasi iniziatore, che permette la visualizzazione diretta di caspasi indotta prossimità seguendo piattaforma di attivazione Assemblea. Questo metodo sfrutta le proprietà della proteina fluorescente Spalato Venus. Venus è un più luminoso e più fotostabile versione di proteina fluorescente gialla (YFP) che possa essere divisi in due frammenti non fluorescenti e leggermente sovrapposti: N-terminale di Venus (Venus N o VN) e C-terminale di Venus (Venus C o VC). Questi frammenti mantengono la capacità di ripiegare e diventa fluorescente quando nella prossimità vicina 13. Ogni frammento di Venus è fuso il propeptide della caspasi, che è la parte minima della caspasi che si lega alla piattaforma di attivazione. Questo assicura che i caspases non mantengono l'attività enzimatica e pertanto sono possibile analisi simultanea degli eventi a valle associati agli eventi endogeni. Il Venus frammenti ripiegare quando il prodomains di caspasi sono reclutati per la piattaforma di attivazione e sottoposti a prossimità indotta. (Figura 1B). La fluorescenza di Venus risultante utilizzabile con precisione e in particolare monitorare la localizzazione subcellulare, la cinetica e l'efficienza dell'Assemblea delle piattaforme di attivazione di caspase iniziatore in singole cellule. Dati di imaging possono essere acquistati mediante microscopia confocale o mediante microscopia a fluorescenza standard e può essere adattato a una serie di approcci di microscopia diversi tra cui: Time-lapse di imaging per monitorare l'attivazione di caspase in tempo reale; formazione immagine ad alta risoluzione per la determinazione precise della localizzazione subcellulare; e la quantificazione di punto finale dell'efficienza dell'attivazione.
Questa tecnica in primo luogo è stata sviluppata per studiare l'attivazione di caspase-214. Mentre la piattaforma di attivazione di caspase-2 è pensata per essere il PIDDosome, che consiste del recettore PIDD (proteina p53-indotta con un dominio di morte) e l'adattatore RAIDD (proteina omologa di RIP-collegata ICH-1/CAD-3 con un dominio di morte), L'attivazione di caspase-2 PIDDosome-indipendente è stata segnalata. Ciò suggerisce che l'attivazione di ulteriori piattaforme per caspase-2 esista 15,16. Pur non sapendo i componenti completo della piattaforma attivazione di caspase-2, la caspasi BiFC tecnica ha permesso per l'interrogatorio di successo delle vie di segnalazione di caspase-2 al livello molecolare 14,17. Abbiamo adattato con successo anche questo protocollo per i caspases infiammatori (caspasi-1, -4, -5 e -12) 18 e, in linea di principio, lo stesso approccio dovrebbe essere sufficiente allo stesso modo analizzare ciascuno dei rimanenti initiator caspases. Questo protocollo allo stesso modo potrebbe essere adattato per studiare altre vie erano dimerizzazione è un importante segnale d'attivazione. Ad esempio, le proteine STAT sono attivati da dimerizzazione dopo fosforilazione da Janus chinasi (JAK) 19. Così, il sistema di BiFC potrebbe essere utilizzato per visualizzare per attivazione STAT così come molte altre vie regolamentati da interazioni proteina dinamico. Il seguente protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'introduzione dei reporter nelle cellule nonché metodologie di analisi e acquisizione delle immagini.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

La famiglia di caspase di proteasi svolgono un ruolo essenziale nell'apoptosi e l'immunità innata. Tra questi, un sottogruppo conosciuto come initiator caspases sono il primo a essere attivato in queste vie. Questo gruppo include il caspase-2, -8 e -9, come pure i caspases infiammatori, caspasi-1, -4 e -5. I caspases iniziatore sono tutti attivati di dimerizzazione successivo all'assunzione di specifici complessi multiproteici chiamati piattaforme di attivazione. Complementazione di caspase bimolecolare fluorescenza (BiFC) è un approccio basato su formazione immagine dove dividere le proteine fluorescenti fuse initiator caspases sono utilizzati per visualizzare il reclutamento delle caspasi iniziatore a loro piattaforme di attivazione e la conseguente prossimità di indotto. Questa fluorescenza consente una lettura di uno dei primi passaggi richiesti per l'attivazione di caspase iniziatore. Utilizzando un numero di differenti approcci basati su microscopia, questa tecnica è in grado di fornire dati quantitativi sull'efficienza dell'attivazione di caspase a livello di popolazione, nonché la cinetica di attivazione delle caspasi e la dimensione e il numero di attivazione di caspase complessi su base per cella.

Nella Figura 3è riportato un esempio di caspase-2 BiFC indotta da danno del DNA. Camptotecine, una topoisomerasi io inibitore, è stato usato per indurre il danno del DNA, attivazione di caspase-2. La mCherry proteina fluorescente rosso è stato utilizzato come reporter per mostrare che le cellule esprimono la sonda BiFC e per aiutare a visualizzare il numero totale di cellule. Fluorescenza di Venus è mostrato in verde e la grande puncta rappresentano caspa...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

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Una pipeline per studiare le strutture e le vie di segnalazione dei recettori della sfingosina 1-fosfato

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...