Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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この技術の開発に貢献した Bouchier ・ ヘイズ ラボのすべての前メンバーを確認したいと思います。この仕事の一部 LBH テキサス子供病院小児パイロット賞によって資金を供給されました。Joya チャンドラ (MD アンダーソン、ヒューストン、テキサス州) は、彼女のチームと共同で公開されているデータを含むようにアクセス許可を感謝いたします。記述されている試薬の開発は NIH (NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 傘下 S10RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の援助からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別コアによって支えられました。

1. 細胞や培養皿の準備
注: 組織培養層流フードの 1-3 の手順に従います。手袋を着用します。
<ol><li>ガラス底培養皿を使用している場合は、フィブロネクチンとガラスをコートします。プラスチック製の食器を使用して手順 1.2 を省略します。<ol>
<li>フィブロネクチンの 0.1 mg/mL の溶液を作る: 9 mL の 1x PBS で 1 mg/mL フィブロネクチン溶液 1 mL を希釈します。</li>
		<li>0.5-1 ?...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

このプロトコルでは、カスパーゼによる近接を測定する蛍光タンパク質を分割の使用について説明します。それは非常に明るく、非常にあると、巻き戻しである高速13分割金星この方法を選ばれました。したがって、カスパーゼ タンパク質相互作用ダイナミクスの実時間推定に近い金星カスパーゼによる近接時に巻き戻しの分析を提供できます。金星は金星 (ヴィーナス N ?...

カスパーゼのプロテアーゼ家族はアポトーシスと免疫1における重要な役割を知られています。重要性のため決定するとき、どこで、どのように効率的に特定のカスパーゼを活性活性化経路カスパーゼのメカニズムに重要な洞察力を提供することができます。ここで説明したイメージング ベースのプロトコルは、カスパーゼ活性化カスケードの最も早いステップの可視化を実現。 にします。この手法は動的蛋白質: 蛋白質の相互作用のドライブのカスパーゼ活性化で活用します。
カスパーゼは、2 つのグループに分けることができます: イニシエーター ・ カスパーゼ (カスパーゼ-1、-2、-4、-5、-8,-9,-10-12) と死刑執行カスパーゼ (カスパーゼ-3、-6、-7)。死刑執行カスパーゼは、前もって形成された二量体として細胞内に存在、大小サブユニット2間の乖離によってアクティブ化されます。アクティブになったとき、彼らはアポトーシス3の結果を多くの構造および調節蛋白質を切断します。イニシエーター ・ カスパーゼは最初カスパーゼ経路でアクティブにし、一般に死刑執行カスパーゼの活性化を誘発します。死刑執行のカスパーゼとは対照的イニシエーター ・ カスパーゼは二量体化4,5によってアクティブ化されます。この二量体は、活性化のプラットフォームとして知られている特定の大きな分子量複合体に非アクティブなモノマーの採用によって促進されます。活性化プラットフォームのアセンブリは、特定の蛋白質: 蛋白質の相互作用のシリーズによって支配されます。これらは、保存されている蛋白質相互作用モチーフ proform イニシエーター ・ カスパーゼの存在によって仲介される、死ドメイン (DD)、死のエフェクター ドメイン (DED) およびカスパーゼ募集ドメイン (カード) 6 (図 1 a)。活性化のプラットフォームは、受容体タンパク質とアダプター蛋白質に通常含まれます。受容体は、リガンドの結合するにより、多数の分子の重合における立体構造変化を誘発する有効になります。受容体、どちらかを募集するカスパーゼ直接または順番に、カスパーゼをもたらす複雑なアダプター分子。したがって、多数のカスパーゼ分子二量体化を許可する近接になります。これは誘導近接モデル7として知られています。二量化、一度、カスパーゼ活性酵素4,8を安定させるのに役立つ自動処理を受けます。たとえば、Apaf1 アポトソームのアセンブリは、シトクロム c がミトコンドリアの外膜透過 (MOMP) と呼ばれるプロセス内のミトコンドリアからのリリースで、以下によってトリガーされます。Apaf1 は、順番カードの両方のタンパク質9の存在によって媒介される相互作用を介してカスパーゼ 9 を募集します。同じような蛋白質の相互作用は、CD95 死の複雑なシグナルを誘導する (ディスク); カスパーゼ 8 の活性化につながるアセンブリカスパーゼ-2; をアクティブにすることができます PIDDosome様々 なインフラマソーム錯体カスパーゼ 1 の活性化10、11,12を開始します。したがって、イニシエーター ・ カスパーゼは、誘起近接と二量体化、活性化は発生しませんなしに共通のメカニズムによって特定の活発化のプラットフォームに募集しています。
カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) はまずこのイニシエーター カスパーゼの活性化を測定するために開発されたイメージング ベースのアッセイ カスパーゼによる近接活性化プラットフォームを次の直接可視化が可能アセンブリ。このメソッドは、分割蛍光タンパク質金星の性質を活用します。金星は明るく、2 つの非蛍光性と少し重複フラグメントに分割でき、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) のより多くのあるバージョン: ヴィーナス (金星 N または VN) と金星 (ヴィーナス C または VC) の C 末端の N 末端。これらのフラグメントは、フォールディングし、近接13時に蛍光になる能力を保持します。金星の各フラグメントは、カスパーゼ活性化プラットフォームへのバインドの最小の部分であるカスパーゼの prodomain に融合されます。これにより、カスパーゼ酵素活性は保持されません、したがって内因性イベントに関連付けられているダウン ストリーム イベントの同時分析が可能です。金星の断片フォールディング カスパーゼ prodomains 活性化プラットフォームを採用し、誘起近接を受けるとき。(図 1 b)。金星の生じる蛍光性は、正確かつ具体的に細胞レベル下のローカリゼーション、速度、および単一細胞におけるイニシエーター カスパーゼ活性化プラットフォームのアセンブリの効率を監視する使用できます。標準蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で得ることができる画像データとを含む各種の顕微鏡のアプローチの数を合わせることができる: リアルタイムでカスパーゼ活性化を追跡するタイムラプス イメージング細胞レベル下のローカリゼーションの正確な決定のための高分解能イメージング終点の活性化効率の定量化。
この手法は、カスパーゼ 214の活性化を調査する最初に開発されました。2 カスパーゼの活性化のプラットフォームは、PIDDosome と考えられている中から成る PIDD (死ドメインと p53 誘導された蛋白質) 受容体とアダプター RAIDD (RIP 関連する ICH-1/CAD-3 死ドメインの相同タンパク質)、PIDDosome 独立 caspase-2 活性化が報告されています。カスパーゼ 2 追加のアクティブ化プラットフォームに15、16が存在することが示唆されました。カスパーゼの活性化プラットフォームの完全なコンポーネントを知らず、にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法はカスパーゼ 2 シグナル伝達経路の分子レベル14,17の成功の尋問のため許可されています。我々 はまた、正常に炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、-12) この議定書を適応している18と、原則として、同じアプローチは、同様に残りのイニシエーター ・ カスパーゼのそれぞれを分析するのに十分なはず。このプロトコルは、合わせることができる同様に二量体化が主要な活性化信号が他の経路を調査します。例えば、Janus のキナーゼ (JAK) 19によってリン酸化、次二量体化 STAT 蛋白質が活性化します。したがって、STAT の活性化だけでなく、動的蛋白質の相互作用によって調整される他の多くの経路を視覚化する BiFC システムを使用可能性があります。次のプロトコルは、画像集録および解析のためのセルに記者の導入のための手順や方法論を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

カスパーゼのプロテアーゼ族は、アポトーシスと自然免疫で重要な役割を再生します。これらのうち、イニシエーター ・ カスパーゼと呼ばれるサブグループこれらの経路でアクティブにする最初のです。このグループ含まれてカスパーゼ-2,-8,-9 と炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、-4 と-5。イニシエーター ・ カスパーゼはすべて活性化プラットフォームと呼ばれる特定の多蛋白質複合体への募集、次二量体化によって活性化します。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) は、カスパーゼはイニシエーター カスパーゼの活性化プラットフォームや結果に募集を視覚化に使用されるイニシエーターに溶ける蛍光蛋白質を分割イメージング ベースのアプローチ誘導近接。この蛍光は、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化のために必要な初期手順の 1 つの読み出しを提供します。異なる顕微鏡ベースのアプローチの数を使用して、このテクニックがカスパーゼ活性化のサイズとカスパーゼ活性化の数の速度と同様に、人口レベルでカスパーゼ活性化の効率の定量的データを提供できます。セルごとに複合体。

カスパーゼ 2 BiFC による DNA 損傷の例は図 3に示します。カンプトテシン、トポイソメラーゼ私阻害剤は DNA の損傷・ カスパーゼ-2 の活性化を誘導するために使用されました。BiFC プローブを細胞に表現をし、セルの合計数を視覚化するために、赤の蛍光タンパク質 mCherry は記者として使用されました。金星蛍光グリーンでは、大涙点を表すカス?...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

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Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

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ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

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蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

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Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...