Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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우리는 모든 이전 멤버 Bouchier 헤이즈 연구소의이 기술 개발에 기여를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 LBH 텍사스 아동 병원 소아 파일럿 수상에 의해 부분적으로 투자 되었다. 우리는 그녀의 팀과 함께 공동에서 출판 된 데이터를 포함 하는 허가 Joya 찬드라 (MD 앤더슨, 휴스턴, 텍사스) 감사 합니다. NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, 및 NCRR S10RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 원조 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 설명 하는 시 약의 개발 지원

1입니다. 셀 및 문화 요리 준비
참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.
<ol><li>경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.<ol>
<li>Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.</li>
		<li>0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 13분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 ?...

Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 1에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.
Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 2사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis 3의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 caspases. 사형 집행 caspases, 달리 초기자 caspases 이합체 화 4,5에 의해 활성화 됩니다. 이 이합체 화 활성화 플랫폼으로 알려진 특정 큰 분자량 단지를 비활성 단위체의 채용에 의해 촉진 된다. 정품 인증 플랫폼의 특정 단백질: 단백질 상호 작용의 일련에 의해 규율 됩니다. 이러한 보존된 단백질 상호 작용 주제 시작자 caspase의 proform에 의해 중재 되 고 죽음 도메인 (DD), 죽음 이펙터 도메인 (DED) 및 caspase 신규 모집 도메인 (카드) 6 (그림 1A)를 포함 합니다. 정품 인증 플랫폼은 일반적으로 수용 체 단백질과 접합 기 단백질을 포함. 수용 체는 일반적으로 수많은 분자의 oligomerization 수 있도록 구조적 변화를 유도 한 ligand의 바인딩 시 활성화 됩니다. 수용 체 다음 중 채용 caspase 직접 또는 어댑터 분자는 차례로 caspase는 복잡 합니다. 따라서, 수많은 caspase 분자 이합체 화를 허용 하는 가까이에 서. 이 유도 근접 모델 7이라고 합니다. 일단, dimerized는 caspase autoprocessing 활성 효소 4,8을 안정화 하는 역할을 겪 습. 예를 들어 Apaf1 apoptosome의 시 토 크롬 c 미토 콘 드리 아 외 막 permeabilization (MOMP) 라는 프로세스에서 미토 콘 드리 아에서 출시를 다음에 의해 트리거됩니다. Apaf1는 차례로 caspase-9 카드 두 단백질 9에 의해 중재 되는 상호 작용을 통해 보충 한다. CD95 죽음의 복잡 한 신호 유도 (디스크) caspase-8 활성화; 리드 어셈블리에 비슷한 단백질 상호 작용 결과 caspase-2;를 활성화할 수 있습니다 PIDDosome 그리고 다양 한 inflammasome 단지 caspase-1 정품 인증 10,,1112을 시작 하는. 따라서, 초기자 caspases는 유도 근접 고 이합체 화 없이 활성화를 발생 하지 것입니다 일반적인 메커니즘에 의해 특정 활성화 플랫폼을 채용.
Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)는 초기자 caspases의 활성화에서이 첫 번째 단계를 측정 하기 위해 개발 된 영상 기반 분석 결과 caspase 유도 근접 다음 활성화 플랫폼의 직접 시각화 어셈블리입니다. 이 방법은 분할 형광 단백질 비너스의 속성 활용합니다. 금성은 더 밝고 비 형광과 약간 겹치는 두 조각으로 분리 될 수 있다 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 더 photostable 버전: 금성 금성 N (VN), 비너스 (금성 C 또는 VC)의 C-말단의 N terminus. 이 파편 refold 될 때 근접 13에 형광을 유지 합니다. 각 비너스 조각 활성화 플랫폼을 caspase의 최소 부분입니다 caspase의 prodomain에 융합 이다. 그러면 그는 caspases 효소 활동을 유지 하지 않습니다 및 따라서 생 이벤트와 관련 된 다운스트림 이벤트의 동시 분석 가능 하다. 금성 파편 refold caspase prodomains 활성화 플랫폼을 채용 하 고 유도 근접을 받 다. (그림 1B)입니다. 결과 금성 형광 정확 하 고 구체적으로 subcellular 지 방화, 활동, 그리고 단일 셀에서 초기자 caspase 활성화 플랫폼의 조립의 효율성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 또는 표준 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 될 수 있다 데이터 이미징 및 다른 현미경 방법 등의 숫자에 적응 시킬 수 있다: 실시간으로; caspase 활성화 추적 시간 경과 영상 subcellular 지 방화;의 정확한 결정을 위한 고해상도 이미징 그리고 활성화의 효율성의 끝점 정량화입니다.
이 기술은 caspase-214의 활성화를 조사 하기 위해 처음 개발 되었다. Caspase-2에 대 한 정품 인증 플랫폼은 PIDDosome 생각 된다, 하는 동안 구성 된 수용 체 PIDD (죽음 도메인으로 유도 하는 p53 단백질)와 RAIDD (죽음 도메인 RIP 관련 ICH-1/CAD-3 동종 단백질), 어댑터 PIDDosome-독립적인 caspase-2 정품 인증 보고 되었습니다. 이 caspase-2에 대 한 추가 활성화 플랫폼 존재 15,16나왔다. 모르고 caspase-2 활성화 플랫폼의 전체 구성 요소, 불구 caspase BiFC 기술은 분자 수준 14,17caspase-2 신호 통로의 성공적인 심문을 위해 허용 했다. 우리 또한 성공적으로이 프로토콜 염증 caspases (caspase-1,-4,-5-12)에 대 한 적응 18 , 원칙적으로, 동일한 접근 마찬가지로 나머지 초기자 caspases의 각각을 분석 하는 것을 충분 해야 한다. 이 프로토콜 마찬가지로 적응 될 수 있는 다른 경로 조사 이합체 화는 주요 활성화 신호 했다. 예를 들어, STAT 단백질 이합체 화 Janus 키 니 아 제 (JAK) 19에 따라 인 산화에 의해 활성화 됩니다. 따라서, BiFC 시스템 합계 활성화 뿐만 아니라 많은 다른 경로 동적 단백질 상호 작용에 의해 규제에 대 한 시각화 사용 될 수 있습니다. 다음 프로토콜 이미지 수집 및 분석을 위한 방법론 뿐만 아니라 세포로 기자 들의 도입에 대 한 단계별 지침을 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물

DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

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Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

구슬에 갈렉틴-3 - U1 snRNP 복합체에 의한 접합 활동의 보완

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...