Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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Nós gostaríamos de reconhecer todos os membros anteriores do laboratório Bouchier-Hayes que contribuíram para o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de piloto pediátrica Hospital infantil do Texas a LBH. Agradecemos Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permissão para incluir dados publicados em colaboração com a equipe dela. O desenvolvimento dos reagentes descrito foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 e NCRR S10RR024574) e a assistência de Joel M. Sederstrom

1. preparação de células e pratos da cultura
Nota: Execute os passos 1-3 em uma capa de fluxo laminar de cultura de tecidos. Use luvas.
<ol><li>Se utilizar pratos de vidro inferior, cubra o vidro com fibronectina. Ignorar a etapa 1.2 se usando pratos de plástico.<ol>
<li>Fazer uma solução de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL da solução de fibronectina 1 mg/mL em 9 mL de 1X PBS.</li>
		<li>Cubra o fundo de vidro de cada poço com 0,5-1 mL de fibronectina e incube por 15 min à te...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Este protocolo discute o uso de proteínas fluorescentes divisão para medir caspase induzida por proximidade. Split Vênus foi escolhida para esta técnica, porque é muito brilhante, altamente fotoestável e a dobrar é rápido 13. Assim, a análise de Vênus dobrar sobre proximidade de caspase induzida pode fornecer perto estimativas em tempo real da dinâmica de interação de proteínas caspase. Vênus é dividida em dois fragmentos ligeiramente sobrepostos, o N-terminal de Vênus (Venus-N ou...

A família de protease caspase é conhecida por seus papéis críticos na apoptose e imunidade inata 1. Por causa de sua importância, determinar quando, onde e quanto à eficácia das caspases específicas são ativadas podem fornecer insights cruciais sobre os mecanismos de caspase vias de ativação. O protocolo baseado em imagem descrito aqui permite a visualização dos primeiros passos para a cascata de ativação de caspase. Esta técnica tira proveito das interações da proteína: proteína dinâmica ativação de caspase naquela unidade.
As caspases podem ser divididas em dois grupos: as caspases de iniciador (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12) e as carrasco caspases (caspase-3, -6 e -7). As caspases carrasco estão presentes na célula como dímeros pré-formadas e são ativadas por clivagem entre os grandes e pequenos subunidade 2. Quando ativado, eles cleave inúmeras proteínas estruturais e reguladoras, resultando em apoptose 3. As iniciador caspases são as caspases primeiras para ser ativado em uma via e geralmente acionar a ativação das caspases carrasco. Em contraste com o carrasco caspases, iniciador caspases são ativadas por dimerização 4,5. Este dimerização é facilitada pelo recrutamento de monômeros inativos para complexos de peso molecular grande específico conhecidos como plataformas de ativação. Montagem de plataformas de ativação é regida por uma série de interações da proteína: proteína específica. Estas são mediadas por motivos de interação de proteínas conservadas presentes no proform de caspase o iniciador e incluem o domínio da morte (DD), domínio effector da morte (DED) e de domínio (cartão) de recrutamento de caspase 6 (figura 1A). Plataformas de ativação incluem geralmente uma proteína do receptor e uma proteína do adaptador. O receptor é normalmente ativado mediante a ligação de um ligante, induzindo uma mudança conformacional que permite a oligomerização de numerosas moléculas. O receptor então também recruta a caspase diretamente ou moléculas do adaptador que por sua vez, trazem a caspase ao complexo. Assim, numerosas moléculas de caspase entram em proximidade que permite dimerização. Isso é conhecido como o modelo de proximidade induzida por 7. Uma vez dimerized, a caspase sofre de autoprocessamento, que serve para estabilizar a enzima activa 4,8. Por exemplo, montagem do apoptossomo Apaf1 é acionada pelo citocromo c após sua libertação da mitocôndria em um processo chamado de permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Apaf1, por sua vez, recruta caspase-9, através de uma interação que é mediada por um cartão presente em ambas as proteínas 9. Semelhante resultado de interações proteína na Assembleia da CD95 morte induzindo sinalização complexo (disco) que leva à ativação de caspase-8; o PIDDosome, que pode ativar caspase-2; e vários inflammasome complexos que iniciam a ativação de caspase-1 10,11,12. Assim, iniciador caspases são recrutadas para plataformas específicas de ativação através de um mecanismo comum, resultando em proximidade induzida e dimerização, sem a qual não ocorrerá ativação.
Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é um ensaio baseado em imagens que foi desenvolvido para medir este primeiro passo na ativação das caspases de iniciador, permitindo a visualização direta da proximidade de caspase induzido após a plataforma de ativação montagem. Este método aproveita-se das propriedades da proteína fluorescente divisão Venus. Vênus é um mais brilhante e mais fotoestável versão de proteína fluorescente amarela (YFP) que pode ser separada em dois fragmentos não-fluorescente e ligeiramente sobrepostos: N-terminal de Vênus (Venus N ou VN) e o C-terminal de Vênus (Venus C ou VC). Estes fragmentos mantêm a capacidade de redobrar e tornar-se fluorescente quando na proximidade de 13. Cada fragmento de Vênus é fundido para o prodomínio da caspase, que é a porção mínima da caspase que vincula-se à plataforma de ativação. Isso garante que as caspases não reter a atividade enzimática e, portanto, a análise simultânea de jusante eventos associados a eventos endógenos é possível. A Vênus de fragmentos redobrar quando os prodomains de caspase são recrutados para a plataforma de ativação e passam por proximidade induzida. (Figura 1B). A fluorescência de Venus resultante pode ser usada com precisão e especificamente monitorar a Localização subcellular, a cinética e a eficiência do conjunto de plataformas de ativação de caspase iniciador em células únicas. Dados de imagem podem ser adquirido por microscopia confocal ou por microscopia de fluorescência padrão e pode ser adaptado para uma série de abordagens diferentes microscopia incluindo: imagem de lapso de tempo para controlar a ativação de caspase em tempo real; imagem de alta resolução para determinações precisas de Localização subcellular; e ponto final quantificação da eficiência de ativação.
Esta técnica foi desenvolvida para investigar a ativação de caspase-214. Enquanto a plataforma de ativação de caspase-2 é pensada para ser o PIDDosome, que consiste do receptor PIDD (proteína p53-induzido com um domínio de morte) e o adaptador RAIDD (RIP-associado ICH-1/CAD-3 proteínas homólogas com um domínio de morte), Ativação de caspase-2 independente de PIDDosome tem sido relatada. Isto sugere que plataformas adicionais de ativação de caspase-2 existem 15,16. Apesar de não saber os componentes completo da plataforma de ativação de caspase-2, permitiu-se a caspase BiFC técnica para interrogatório bem sucedido das vias sinalização caspase-2 para o nível molecular 14,17. Adaptámos também com êxito este protocolo para as caspases inflamatórias (caspase-1, -4, -5 e -12) 18 e, em princípio, a mesma abordagem deve ser suficiente para da mesma forma, analisar cada uma das caspases restantes do iniciador. Este protocolo da mesma forma pode ser adaptado investigar outros caminhos foram dimerização é um grande sinal de ativação. Por exemplo, as proteínas STAT são ativadas por dimerização após fosforilação por Janus quinase (JAK) 19. Assim, o sistema de BiFC pode ser usado para visualizar para ativação STAT, bem como muitas outras vias reguladas por interações proteína dinâmico. O seguinte protocolo fornece instruções passo a passo para a introdução dos repórteres em células, bem como as metodologias de análise e aquisição de imagem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

A família de caspase de proteases desempenham um papel essencial na apoptose e imunidade inata. Entre estes, um subgrupo conhecido como iniciador caspases são os primeiros a ser ativado nestes caminhos. Este grupo inclui caspase-2, -8 e -9, bem como as caspases inflamatórias, caspase-1, -4 e -5. As caspases iniciador são todos ativadas por dimerização seguir ao recrutamento de complexos Multiproteicos específicos, chamados de plataformas de ativação. Complementação de fluorescência caspase Bimolecular (BiFC) é uma abordagem baseada em imagem onde dividir proteínas fluorescentes fundidas ao iniciador caspases são usadas para visualizar o recrutamento das caspases iniciador de suas plataformas de ativação e o resultante induzida por proximidade. Esta fluorescência fornece uma leitura de um dos primeiros passos necessários para a ativação de caspase iniciador. Usando um número de diferentes abordagens baseadas em microscopia, esta técnica pode fornecer dados quantitativos sobre a eficiência da ativação de caspase em um nível de população, bem como a cinética de ativação de caspase e o tamanho e o número de ativação de caspase complexos em uma base por célula.

Um exemplo de caspase-2 BiFC induzida por dano do ADN é mostrado na Figura 3. Camptothecin, uma topoisomerase eu inibidor, foi usado para induzir danos e caspase-2 ativação do DNA. O mCherry da proteína fluorescente vermelha foi usado como um repórter para mostrar que as células expressam a sonda BiFC e para ajudar a visualizar o número total de células. Fluorescência de Vênus é mostrada em verde e a grande partitura representam caspase-2 induzido ...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Este protocolo descreve caspase Bimolecular complementação de fluorescência (BiFC); um método baseado em imagens que pode ser usado para visualizar induzida proximidade das caspases de iniciador, que é o primeiro passo para sua ativação.

Iluminando os caminhos para a ativação de Caspase usando fluorescência Bimolecular complementação

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