Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
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Nos gustaría reconocer a todos los miembros anteriores del laboratorio Bouchier-Hayes que contribuyeron al desarrollo de esta técnica. Este trabajo fue financiado en parte por el Premio de piloto pediátrica Hospital infantil Texas a LBH. Agradecemos a Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) permiso para incluir los datos publicados en colaboración con su equipo. El desarrollo de los reactivos descritos fue apoyado por la citometría y base de clasificación de la célula en el Baylor College of Medicine con la financiación de los NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 y NCRR S10RR024574) y la asistencia de Joel M. Sederstrom

1. preparación de células y platos de la cultura
Nota: Realice los pasos 1-3 en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos. Guantes.
<ol><li>Si usando platos de fondo de vidrio, capa del vidrio con fibronectina. Si utiliza platos de plástico, vaya al paso 1.2.<ol>
<li>Hacer una solución de 0,1 mg/mL de fibronectina: diluir 1 mL de solución de fibronectina de 1 mg/mL en 9 mL de 1 X PBS.</li>
		<li>Cubrir el fondo del vidrio de cada pozo con 0.5-1 mL de fibronectina e incubar dura...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Este protocolo trata el uso de proteínas fluorescentes split para medir caspasas inducida por proximidad. Venus de Split fue elegida para esta técnica porque es muy brillante, altamente Fotoestables y el refolding es rápido 13. Así, el análisis de Venus refolding sobre proximidad de caspasas inducida puede proporcionar cerca de las estimaciones en tiempo real de la dinámica de interacción de la proteína caspasa. Venus se divide en dos fragmentos ligeramente superpuestas, la terminal N de V...

La familia de proteasas caspasas es conocida por su crítico papel en apoptosis e inmunidad innata 1. Debido a su importancia, determinar cuándo, dónde y sobre la eficacia específicas caspasas son activadas puede proporcionar información crucial sobre los mecanismos de la caspasa vías de activación. El protocolo basado en proyección de imagen se describe aquí permite la visualización de los pasos más tempranos en la cascada de activación de la caspasa. Esta técnica aprovecha las interacciones proteína: proteína dinámica activación de la caspasa en coche.
Las caspasas pueden dividirse en dos grupos: los iniciadores de caspasas (caspasa-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 y -12) y el verdugo caspasas (caspasa-3, -6 y -7). El verdugo caspasas están presentes en la célula como dímeros preformadas y son activadas por clivaje entre las subunidades grandes y pequeñas 2. Cuando se activa, hienden numerosas proteínas estructurales y reguladoras, dando como resultado apoptosis 3. Los iniciadores de caspasas son las caspasas primera a activarse en un camino y generalmente desencadenan la activación de las caspasas de verdugo. En contraste con verdugo caspasas, iniciadores de caspasas son activadas por dimerización 4,5. Esta dimerización facilita el reclutamiento de monómeros inactivos a complejos de peso molecular grande específico conocidos como plataformas de activación. Montaje de plataformas de activación se rige por una serie de interacciones proteína: proteína específica. Estas son mediadas por motivos de interacción proteína conservada presentes en proform de lo caspase del iniciador e incluyen el dominio de la muerte (DD), dominio efector de muerte (DED) y caspasas reclutamiento dominio (CARD) 6 (figura 1A). Plataformas de activación generalmente incluyen una proteína receptora y una proteína del adaptador. El receptor se activa generalmente en Unión de un ligando, induce un cambio conformacional que permite la Oligomerización de numerosas moléculas. El receptor entonces recluta o la caspasas directamente o moléculas del adaptador que a su vez la caspasa al complejo. Así, numerosas moléculas caspasa entran en proximidad, que permite la dimerización. Esto se conoce como el modelo de proximidad inducida por 7. Una vez dimerized, la caspasa experimenta autoprocessing, que sirve para estabilizar la enzima activa 4,8. Por ejemplo, el montaje del apoptosome Apaf1 es accionada por citocromo c tras su liberación de la mitocondria en un proceso llamado permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP). Apaf1 alternadamente recluta a caspasa-9 a través de una interacción que es mediada por una tarjeta presente en dos de las proteínas 9. Similar resultado de interacciones de proteínas en la Asamblea del CD95 muerte induce señalización complejo (disco) que conduce a la activación de la caspasa-8; el PIDDosome, que puede activar la caspasa-2; y varios complejos de inflammasome que inician la activación de la caspasa-1 10,11,12. Por lo tanto, iniciadores de caspasas son reclutados a plataformas de activación específico por un mecanismo común en proximidad inducida y dimerización, sin la cual no se producirá la activación.
Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un ensayo basado en la proyección de imagen que se desarrolló para medir este primer paso en la activación de las caspasas de iniciador, que permite la visualización directa de la proximidad de caspasas inducida tras la plataforma de activación Asamblea. Este método aprovecha las propiedades de la proteína fluorescente split Venus. Venus es un más brillante y más Fotoestables versión de proteína fluorescente amarilla (YFP) que puede dividirse en dos fragmentos no fluorescente y ligeramente superpuestos: el N-terminal de Venus (Venus N o VN) y el C-terminal de Venus (Venus C o VC). Estos fragmentos conservan la capacidad de replegar y fluorescente en cerca de 13. Cada fragmento de Venus está fusionada a la prodomain de las caspasas, que son la mínima porción de la caspasa que se une a la plataforma de activación. Esto asegura que las caspasas no retienen actividad enzimática y por tanto es posible el análisis simultáneo de posteriores eventos asociados con eventos endógenos. Venus los fragmentos doblados cuando las prodomains caspasas son reclutados a la plataforma de activación y experimentar la proximidad inducida. (Figura 1B). La fluorescencia resultante de Venus puede utilizarse con precisión y específicamente monitorear la localización subcelular, la cinética y la eficacia del conjunto de plataformas de activación de caspasas de iniciador en las células. Datos de la proyección de imagen puede ser adquirido por microscopía confocal o por microscopía de fluorescencia estándar y puede ser adaptado a una serie de microscopía diferentes incluyendo: Time-lapse de imágenes para el seguimiento de la activación de caspasas en tiempo real; proyección de imagen de alta resolución para la determinación precisa de la localización subcelular; y cuantificación de la punto final de eficacia de la activación.
Esta técnica se desarrolló inicialmente para investigar la activación de la caspasa-214. Mientras que la plataforma de activación de la caspasa-2 se cree que el PIDDosome, compuesto por el receptor PIDD (inducida por p53 proteína con un dominio de la muerte) y el adaptador RAIDD (RIP-asociado de ICH-1/CAD-3 proteína homóloga con un dominio de la muerte), Se ha reportado activación de caspasa-2 PIDDosome-independiente. Esto sugiere que las plataformas de activación adicional para la caspasa-2 existen 15,16. A pesar de no saber los componentes completos de la plataforma de activación de la caspasa-2, caspasa centro técnica ha permitido eficazmente los interrogatorios de las vías de señalización de caspasa-2 en el nivel molecular 14,17. También hemos adaptado este protocolo para las caspasas inflamatoria (caspasa-1, -4, -5 y -12) 18 y, en principio, el mismo enfoque debería ser suficiente analizar del mismo modo cada uno de los restantes caspasas iniciador. Este protocolo de manera similar podría ser adaptado investigar otras vías era dimerización es una importante señal activadora. Por ejemplo, las proteínas STAT se activan por dimerización por fosforilación de Janus quinasa (JAK) 19. Así, el sistema de centro podría utilizarse para visualizar tendencia activación así como muchas otras vías regulados por las interacciones de la dinámica de la proteína. El siguiente protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la introducción de los reporteros en las células, así como metodologías para el análisis y la adquisición de la imagen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

La familia de caspasas de proteasas juega un papel esencial en la inmunidad innata y la apoptosis. Entre ellos, un subgrupo conocido como iniciadores de caspasas son los primeros en activarse en estas vías. Este grupo incluye a caspasa-2, -8, -9, como la inflamatoria caspasas caspasa-1, -4 y -5. Todos los iniciadores de caspasas son activadas por dimerización después de reclutamiento a complejos de multiproteínas específicos llamados plataformas de activación. Caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro) es un enfoque basado en la proyección de imagen de donde se dividen proteínas fluorescentes fusionadas al iniciador de caspasas se utilizan para visualizar el reclutamiento de las caspasas de iniciador a sus plataformas de activación y la resultante proximidad inducida. Esta fluorescencia proporciona una lectura de uno de los primeros pasos necesarios para la activación de caspase del iniciador. Utilizando un número de diferentes enfoques basados en la microscopía, esta técnica puede proporcionar datos cuantitativos sobre la eficacia de la activación de caspasas en un nivel de población, así como la cinética de la activación de caspasas y el tamaño y número de activación de la caspasa complejos de forma por la célula.

En la figura 3se muestra un ejemplo de centro de caspasa-2 inducida por daño en el ADN. Camptotecina, una topoisomerasa I inhibidor, fue utilizado para inducir daño y caspasa-2 activación de ADN. La proteína fluorescente roja mCherry fue utilizado como reportero para demostrar que las células expresan la sonda del centro y para ayudar a visualizar el número total de células. Fluorescencia de Venus se muestra en verde y el orificio grande representan ca...

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Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

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Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...