Name: lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Bu tekniğin gelişimine katkıda bulunan tüm önceki üyeleri Bouchier-Hayes laboratuvar kabul etmek istiyoruz. Bu eser kısmen bir Texas Çocuk Hastanesi Pediatrik Pilot Ödülü LBH tarafından finanse edildi. Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Teksas) ekibi ile işbirliği içinde yayımlanan verileri eklemek izin için teşekkür ediyoruz. Açıklanan reaktifler gelişimi NIH (NIAID P30AI036211, ncı P30CA125123 ve NCRR S10RR024574) ve Joel M. Sederstrom yardımıyla fon ile sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir

1. hücre ve kültür yemeklerin hazırlanması
Not: Bir doku kültürü laminar akış mahallede 1-3 adımları gerçekleştirin. Eldiven giymek.
<ol><li>Cam alt yemekleri kullanıyorsanız, fibronektin ile cam ceket. Adım 1.2 için plastik yemekleri kullanıyorsanız atlayın.<ol>
<li>Fibronektin bir 0.1 mg/mL solüsyon olun: 1 mL 1 mg/mL fibronektin çözeltisi 1 X PBS 9 ml seyreltik.</li>
		<li>Kapak cam kuyunun her 0.5-1 mL fibronektin ve oda sıcaklığında 1-5 min için kuluçkaya.<...

<ol>
	<li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+mechanisms.">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li><li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+caspase+activation.">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li><li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CASBAH:+a+searchable+database+of+caspase+substrates.">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li><li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation.">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li><li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+domains+of+death:+evolution+of+the+apoptosis+machinery.">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li><li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation:+the+induced-proximity+model.">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li><li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation.">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li><li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apoptosome:+signalling+platform+of+cell+death.">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PIDDosome,+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress.">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation.">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li><li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2.">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus.">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).</li><li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+road+map+for+those+who+don't+know+JAK-STAT.">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li><li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953 (2016).</li><li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li><li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions.">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li><li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis.">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li><li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling.">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation.">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li><li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing.">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li><li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade:+hierarchical+activation+of+caspases-2,+-3,+-6,+-7,+-8,+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner.">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li></ol>

Bu iletişim kuralı split floresan proteinler indüklenen caspase yakınlık ölçmek için kullanmayı açıklar. Çünkü çok zeki, çok photostable ve refolding hızlı 13olduğunu Split Venüs bu teknik için seçildi. Böylece, indüklenen caspase yakınlık refolding Venüs analizini caspase protein etkileşim dynamics gerçek zamanlı tahminler yakın sağlayabilir. Venüs iki biraz örtüşen parçalara, Venüs (Venüs-N veya VN) oluşan amino asitler 1-173 N terminus ayrılır ve C term...

Caspase proteaz aile kritik rollerine Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık 1bilinmektedir. Onların önemi nedeniyle, ne zaman, nerede ve nasıl verimli bir şekilde belirlenmesi belirli caspases aktif çok önemli caspase mekanizmaları harekete geçirmek yolları kazandırabileceğini. Burada açıklanan görüntüleme tabanlı iletişim kuralı caspase harekete geçirmek cascade ilk adımda görselleştirme sağlar. Bu teknik, bu sürücü caspase etkinleştirme dinamik protein: protein etkileşimleri yararlanır.
Caspases iki gruba ayrılabilir: Başlatıcı caspases (caspase-1, -2, -4, -5 -8 -9, -10 ve -12) ve Cellat caspases (caspase-3, -6 ve -7). Cellat caspases ön şekillendirilmesi dimer hücrede mevcut ve büyük ve küçük alt birim 2arasında bir bölünme tarafından aktif hale gelir. Etkinleştirildiğinde, onlar apoptosis 3' te sonuçlanan çok sayıda yapısal ve düzenleyici proteinler ayırmak. Başlatıcı caspases bir yolu var olmak harekete geçirmek ve genellikle Cellat caspases aktivasyonu tetiklemek için ilk caspases vardır. Cellat caspases aksine, başlatıcı caspases dimerization 4,5tarafından etkinleştirilir. Bu dimerization harekete geçirmek platformlar bilinen belirli büyük molekül ağırlığı kompleksleri için etkin olmayan monomerleri alımı tarafından yönetilir. Derleme etkinleştirme platformlarının bir dizi belirli protein: protein etkileşimler tarafından yönetilir. Bunlar tarafından korunmuş protein etkileşim motifleri mevcut başlatıcı caspase proform aracılı ve ölüm etki alanı (DD), ölüm efektör etki alanı (DED) ve caspase işe alım etki alanı (kart) 6 (şekil 1A) içerir. Harekete geçirmek platformlar genellikle bir reseptör protein ve bir adaptör protein içerir. Reseptör genellikle çok sayıda molekülleri Oligomerizasyonda için sağlar bir konformasyonal değişim inducing bir ligand bağlanması üzerine devreye girer. Reseptör sonra da caspase doğrudan veya sırayla getirmek caspase kompleksi için adaptör molekül acemi. Böylece, çok sayıda caspase molekülleri yakın dimerization izin gelmek. Bu indüklenen yakınlık modeli 7olarak bilinir. Dimerized sonra caspase aktif enzim 4,8stabilize etmek için hizmet vermektedir işlenirken uğrar. Örneğin, Apaf1 apoptosome Meclisi yayınlandıktan sonra mitokondri mitokondrial dış membran permeabilization (MOMP) denen bir süreç üzerinden sitokrom c tarafından tetiklenir. Apaf1 caspase-9 her iki proteinler 9' mevcut bir kartıyla aracılık ettiği bir etkileşimi aracılığıyla sırayla acemi. Caspase-8 harekete geçirmek yol açan karmaşık sinyal inducing CD95 ölüm (disk) Meclisi benzer protein etkileşimleri sonucunda; caspase-2-ebilmek harekete geçirmek PIDDosome; ve caspase-1 harekete geçirmek 10,11,12başlatmak çeşitli inflammasome kompleksleri. Böylece, başlatıcı caspases belirli harekete geçirmek platformları için indüklenen yakınlık ve dimerization, hangi olmadan harekete geçirmek gerçekleşmez sonuçlanan bir ortak mekanizma ve suikastler falan.
Harekete geçirmek platformu takip caspase indüklenen yakınlık doğrudan görselleştirme izin başlatıcı caspases, harekete geçirmek bu ilk adımda ölçmek için geliştirilmiş bir görüntüleme tabanlı tahlil Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) olduğunu derleme. Bu yöntem, split floresan protein Venüs özelliklerini yararlanır. Venüs olduğunu bir daha parlak ve daha photostable sürümü iki sigara floresan ve biraz örtüşen parçalara ayrılmış sarı floresan protein (YFP): N-terminus Venüs (Venüs N veya VN) ve C-terminus, Venüs (Venüs C veya VC). Bu parçaları yeteneği refold ve yakın 13zaman floresan haline korur. Her Venüs parça harekete geçirmek platforma bağlar caspase çok az bölümü olan caspase, prodomain için erimiş. Bu caspases enzimatik aktivite korur ve bu nedenle eşzamanlı akış aşağı olaylar endojen olaylar ile ilişkili olası analizidir sağlar. Ne zaman caspase prodomains harekete geçirmek platforma işe ve indüklenen yakınlık tabi Venüs e saldırı indirgenmesi parçaları. (Şekil 1B). Elde edilen Venüs Floresans doğru ve özellikle hücre altı yerelleştirme, kinetik ve başlatıcı caspase harekete geçirmek platformlar Tek Kişilik hücrelerde Meclisi etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Veri görüntüleme confocal mikroskopi veya standart floresan mikroskopi elde edilebilir ve dahil olmak üzere farklı mikroskobu yaklaşımlar bir dizi için adapte edilebilir: hızlandırılmış caspase harekete geçirmek gerçek zamanlı; izlemek için görüntüleme yüksek kararlılık düşsel hücre altı yerelleştirme kesin tayini için; ve bitiş noktası miktar verimlilik etkinleştirme.
Bu teknik ilk caspase-214aktivasyonu araştırmak için geliştirilmiştir. Caspase-2 için harekete geçirmek platform PIDDosome olduğu düşünülen iken, reseptör PIDD (protein p53 kaynaklı bir ölüm etki ile) oluşan ve adaptör RAIDD (RIP ilişkili Ich-1/CAD-3 homolog protein ölüm etki alanı ile), PIDDosome bağımsız caspase-2 aktivasyon bildirilmiştir. Bu ek harekete geçirmek platformlar için caspase-2 15,16var olduğunu göstermektedir. Caspase-2 aktivasyon platformun tam bileşenleri bilmeden rağmen caspase BiFC tekniği başarılı sorgulama moleküler düzeyde 14,17caspase-2 sinyal yollar için izin verdi. Biz de başarıyla bu protokol inflamatuar caspases (caspase-1, -4, -5 ve -12) için adapte olması 18 ve prensip olarak, aynı yaklaşımı benzer şekilde her kalan başlatıcı caspases analiz için yeterli olmalıdır. Bu iletişim kuralı benzer şekilde adapte olabilir diğer yolları araştırmak için dimerization büyük aktive sinyal edilmistir. Örneğin, STAT protein fosforilasyon Janus kinaz (JAK) 19tarafından takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Böylece, BiFC sistemi için STAT harekete geçirmek hem de dinamik protein etkileşimler tarafından düzenlenmiş birçok yollar görselleştirmek için kullanılabilir. Aşağıdaki iletişim kuralı resim alma ve çözümleme için gazetecilere hücreye giriş için adım adım yönergeler yanı sıra yöntemleri sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P06G-1.5-20-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI MEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VC plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2-Pro VN plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available by request from LBH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>q-VD-OPH</td>
			<td>Apex Bio</td>
			<td>A1901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation

Proteaz caspase ailesinin Apoptozis ve doğuştan gelen bağışıklık önemli rol oynarlar. Başlatıcı caspases bilinen bir alt Bunlar arasında ilk bu yollar var olmak harekete geçirmek. Grup caspase-2, içerir -8 ve -9 gibi inflamatuar caspases, caspase-1, -4 ve -5. Başlatıcı caspases tüm işe alım harekete geçirmek platformlar olarak adlandırılan belirli multiprotein kompleksleri için takip dimerization tarafından etkinleştirilir. Caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC) nerede floresan proteinler caspases başlatıcı caspases onların harekete geçirmek platformları ve sonucu olan alımı görselleştirmek için kullanılan başlatıcı için erimiş bölünmüş bir görüntü tabanlı yaklaşımdır indüklenen yakınlık. Bu floresan bir okuma bir başlatıcı caspase harekete geçirmek için gerekli ilk adımları sağlar. Farklı mikroskobu tabanlı yaklaşımlar bir dizi kullanarak, bu teknik Nicel veri caspase harekete geçirmek bir nüfus düzeyde verimliliğini yanı sıra caspase harekete geçirmek ve caspase etkinleştirme sayısı ve boyutu Kinetik sağlayabilirsiniz Hücre başına temelinde kompleksleri.

Caspase-2 BiFC DNA hasar tarafından indüklenen örneği şekil 3' te gösterilmiştir. Camptothecin, bir topoizomeraz ı inhibitörü, DNA hasarı ve caspase-2 aktivasyon ikna etmek için kullanıldı. Kırmızı floresan protein mCherry bir muhabir olarak hücreleri BiFC sonda hızlı göstermek için ve hücre toplam sayısı görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılmıştır. Venüs Floresans yeşille gösterilmiş ve büyük puncta temsil eden ...

Watch this Scientific Journal Video about Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation at JoVE.com

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Boncuklar Üzerinde Galectin-3 - U1 snRNP Kompleksi ile Birleştirme Etkinliğinin Tamamlayıcısı

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...