Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Vi takker Rachael B. Chanin og Alejandro Llanos-Chea for teknisk bistand. Vi takker Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski og Bobby Cherayil for de stammer, der er anvendt i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme Grant K22AI104755 (C.S.F.). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

1. forberedelse af reagenser
<ol><li>Galdesalte medium: for at forberede tryptic soja bouillon (TSB) der indeholder galdesalte 0,4% (vægt/volumen), resuspend 200 mg af galdesalte i 50 mL autoklaveres TSB. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter. Gøre friske medium ugentligt. Noter: Galdesalte rutinemæssigt anvendes er en 1:1 blanding af natrium cholat og natrium deoxycholate isoleret fra får og kvæg gallbladders. Som det fremgår tidligere4, var tilstedeværelsen af glucose p...

Analyse af Biofilmdannelse er udfordrende på grund af den dynamiske natur af biofilm og variabiliteten mellem stammer, materialer, laboratorier og assays. Her præsenteres flere strategier for at bestemme Biofilmdannelse i enterisk patogener efter galdesalte eksponering med eksperimentelle indsigt til fremme reproducerbarhed. Der er yderligere overvejelser at sikre reproducerbarhed. Først og fremmest anbefaler vi udfører mindst tre uafhængige forsøg hver med tekniske tre at bekræfte observationer og Statistisk sign...

Biofilmdannelse er en vigtig bakteriel overlevelsesstrategi induceret under hårde miljømæssige forhold. Eksponering for bakteriedræbende stoffer som antibiotika eller ændringer i næringsstof eller ilt tilgængelighed inducerer en stresset tilstand i bakterier, der kan afhjælpes gennem Biofilmdannelse. En biofilm er karakteriseret ved bakteriel vedhæftet fil til en overflade eller andre bakterier og er ledsaget af udskillelsen af en EPS-matrix primært består af polysaccharider1,2,3. Biofilmdannelse er en dynamisk proces, hvor en kaskade af begivenheder kulminerer i dannelsen af en moden vedhængende bakteriel EF1,2,3. Bakterier producere adhesins for at fremme tidlig vedhæftet fil mens skiftende adhesin gen expression profiler for at styrke vedhæftet fil under biofilm modning. Samtidigt, sker EPS-produktion til pels bakteriel Fællesskabet i en matrix til at beskytte celler fra den oprindelige stressor. Bakterier findes i biofilm er langsomt voksende; og som sådan gør de fleste antibiotika ineffektive. Desuden, den langsomme vækst sparer energi, indtil forholdene ændrer til at favorisere bakterievækst1,2,3. Efter de barske forhold har bestået, bakterier spredes biofilm og genoptage en planktoniske livsstil1,2,3. Traditionelt biofilm er observeret på overflader og repræsentere en vedvarende klinisk udfordring på grund af infektion reservoirer til stede på katetre og i boligen enheder1,2,3.
Biofilmdannelse blev for nylig beskrevet for flere enterisk patogener; bakterier, der inficerer tyndtarmen eller tyktarmen4. For Shigella arter, opstår infektion i den menneskelige kolon efter transit gennem størstedelen af mave-tarmkanalen. Under passagen gennem tyndtarmen, er Shigella udsat for galde; et lipid-nedbrydende vaskemiddel udskilles i tarmen til at lette fordøjelsen af lipider mens samtidig dræber de fleste bakterier5. Enterisk patogener har en unik evne til at modstå bakteriedræbende virkningerne af galde6. Vores seneste analyse udnyttet i vivo-indkvartering kombinationer af glucose og galdesalte at demonstrere robust Biofilmdannelse i S. flexneri samt andre arter af Shigella, patogene Escherichia coliog Salmonella4. Tidligere, Salmonella enterica serovar Typhi blev vist til at danne en galde-induceret biofilm på grund af unikke kolonisering af galdeblæren under kronisk infektion7,8,9, 10. Derudover tidligere forskning med Vibrio11og Campylobacter12 demonstreret Biofilmdannelse svar på galde. Derfor analyserne udvidet galde-induceret biofilm dannelse bemærkninger til andre patogener og bidrage til at etablere demonstration af en bevaret enterisk patogen svar på galde. I modsætning til kronisk biofilm hvor bakterielt gen transskription er begrænset, og celle ældning kan forekomme1,2,3, foreslår vi, at den enteriske galde-induceret biofilm er mere forbigående karakter. Denne forbigående, virulent biofilm er stemplet af en hurtig afmontering (som ses i dispersion assay) og forøget virulence genekspression observeret i biofilm befolkning4,6. 
Biofilmdannelse er en mangesidet, dynamisk proces og anvendelsen af galde salte som en igangsættende faktor er kun blevet for nylig beskrevet for mest enterisk patogener, er værktøjer og teknikker, der anvendes unikke og kreative anvendelser af traditionelle metoder. Derfor er præsenteres her tre gratis strategier til at kvantificere flere vigtige egenskaber af galde salt-induceret Biofilmdannelse, herunder bakteriel tilslutning, produktion af EPS-matrix, og spredning af levedygtige bakterier fra biofilm. Disse teknikker har været udnyttet primært for forskning med Shigella; og derfor, evaluering af andre enteriske patogener kan kræve optimering. Ikke desto mindre, positive data fra alle tre assays støtte identifikation af biofilm og fastlægge reproducerbare protokoller for galde salt-induceret Biofilmdannelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilmdannelse er en dynamisk, flertrins proces, der forekommer i bakterier under hårde miljømæssige forhold eller tider med stress. For enterisk patogener, er en betydelig stressrespons induceret under gastrointestinal transit og galde eksponering, en normal del af menneskers fordøjelse. For at overvinde de bakteriedræbende virkninger af galde, udgøre mange enteriske patogener en biofilm hypotese for at muliggøre overlevelse, når transit gennem tyndtarmen. Her præsenterer vi metoder for at definere Biofilmdannelse gennem solid-faset tilslutning assays samt ekstracellulære polymert stof (EPS) matrix påvisning og visualisering. Derudover præsenteres biofilm spredning vurdering for at efterligne analyse af begivenheder udløser frigivelse af bakterier under infektion oparbejde. Krystalviolet farvning bruges til at påvise vedhængende bakterier i en høj overførselshastighed 96-brønd plade overholdelse assay. EPS-produktion vurdering bestemmes af to assays, nemlig mikroskopi farvning af EPS-matrix og semi-kvantitative analyse med en fluorescently-konjugeret polysaccharid bindende lektin. Endelig måles biofilm spredning gennem koloni tæller og plating. Positive data fra flere assays støtte karakterisering af biofilm og kan udnyttes til at identificere galde salt-induceret Biofilmdannelse i andre bakterielle stammer.

I figur 1, er Biofilmdannelse induceret i de fleste af de seks enterisk patogener testet følgende vækst i medie, der indeholder galdesalte. En betydelig stigning i vedhængende bakterier efter galdesalte eksponering er observeret i næsten alle stammer testet. Undtagelsen er enteroaggregative E. coli (Euratom); men Bemærk den inducerede observation af Δaaf mutant4. Resultaterne tyder på, at overholdelse...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Denne protokol det muligt for læseren at analysere galde salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener ved hjælp af en mangefacetteret tilgang til at fange den dynamiske karakter af bakterielle biofilm ved vurderingen af overholdelse, ekstracellulære polymert stof matrix dannelse, og dispersion.

Galde Salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener: teknikker til identifikation og kvantificering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Brug fluorescerende proteiner til Monitor Glycosome dynamik i det afrikanske trypanosominfektion

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifikation af sjældne bakterielle patogener ved 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Kvantificering af monocyt Transmigration og skum celle dannelse fra personer med kroniske betændelsestilstande

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisere leukocyt rullende og vedhæftning i Angiotensin II-infunderes mus: teknikker og faldgruber

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Real-time Imaging og kvantificering af svampe Biofilm udvikling ved hjælp af en 2-faset recirkulerende Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...