Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Wij danken Rachael B. Chanin en Alejandro Llanos-Chea voor technische bijstand. Wij danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski en Bobby Cherayil voor de spanningen in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten Grant K22AI104755 (C.S.F.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

1. bereiding van reagentia
<ol><li>Galzouten medium: resuspendeer ter voorbereiding al soja Bouillon (TSB) met 0,4% galzouten (gewicht/volume), 200 mg van galzouten in 50 mL gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Maak wekelijks vers medium. Opmerkingen: De galzouten routinematig gebruikt is een 1:1 mengsel van natrium cholate en natrium deoxycholate van schapen en runderen gallbladders geïsoleerd. Zoals aangetoond eerder4, was de aanwezighe...

Analyse van biofilm vorming is uitdagend vanwege de dynamische aard van biofilms en de variabiliteit tussen de stammen, materialen, laboratoria en testen. Hier zijn verschillende strategieën om te bepalen van biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers na galzouten blootstelling met experimentele inzicht geboden ter bevordering van de reproduceerbaarheid gepresenteerd. Er zijn aanvullende overwegingen om de reproduceerbaarheid. Eerst en vooral, is het raadzaam voor het uitvoeren van ten minste drie onafhankelijke expe...

Biofilm formatie is een belangrijke bacteriële overlevingsstrategie geïnduceerde tijdens Barre milieu omstandigheden. Blootstelling aan bactericide verbindingen zoals antibiotica of veranderingen in voedingsstoffen of zuurstof beschikbaarheid induceert een gespannen staat in bacteriën die kan worden verlicht door vorming van biofilms. Een biofilm wordt gekenmerkt door bacteriële gehechtheid aan een oppervlak of andere bacteriën en wordt begeleid door de afscheiding van een matrix van de EPS-voornamelijk samengesteld uit polysacchariden1,2,3. Biofilm vorming is een dynamisch proces waarin een cascade van gebeurtenissen in de vorming van een volwassen aanhangend bacteriële Gemeenschap1,2,3 culmineert. Bacteriën produceren adhesines om vroege bijlage terwijl shifting adhesine gen expressieprofielen ter versterking van de bijlage tijdens biofilm rijping. EPS-productie komt tegelijkertijd jas de bacteriële Gemeenschap in een matrix te beschermen de cellen van de eerste stressor. Bacteriën die deel uitmaakt van de biofilm zijn traag groeiende; en als zodanig, maakt de meeste antibiotica ondoeltreffend. Bovendien, de trage groei bespaart energie tot omstandigheden veranderen om de gunst van de bacteriële groei1,2,3. Na de barre omstandigheden zijn verstreken, bacteriën verspreiden de biofilm en een planktonische levensstijl1,2,3te hervatten. Traditioneel, biofilms zijn waargenomen op oppervlakken en vertegenwoordigen een persistente klinische uitdaging als gevolg van infectie reservoirs aanwezig op katheters en in-woning apparaten1,2,3.
Biofilm vorming werd onlangs beschreven voor verschillende darmen ziekteverwekkers; bacteriën die de dunne darm of dikke darm4 infecteren. Voor Shigella soorten, infectie treedt op in de menselijke darm na een doorvoer over de meerderheid van het maag-darmkanaal. Tijdens de passage door de dunne darm, is Shigella blootgesteld aan gal; een lipide-vernederende wasmiddel uitgescheiden naar de darm te vergemakkelijken van vertering van lipiden terwijl het tegelijkertijd het doden van de meeste bacteriën5. Darmen ziekteverwekkers hebben een unieke vermogen om te weerstaan aan het bactericide effect van gal6. Onze recente analyse gebruikt in vivo-als combinaties van glucose en galzouten om aan te tonen van robuuste biofilm vorming in S. flexneri en andere soorten Shigella, pathogene Escherichia colien Salmonella4. Eerder, Salmonella enterica serovar Typhi bleek te vormen van een biofilm gal-geïnduceerde als gevolg van de unieke kolonisatie van de galblaas bij chronische infectie7,8,9, 10. Daarnaast voorafgaande onderzoek met Vibrio11en Campylobacter12 biofilm vorming in reactie op Gal aangetoond. Dus, de analyses uitgebreid de gal-geïnduceerde biofilm vorming opmerkingen bij andere ziekteverwekkers en helpen om de demonstratie van een reactie van de geconserveerde darmen pathogen op Gal. In tegenstelling tot chronische biofilms waarin bacteriële gene transcriptie is beperkt en cel senescentie kan het optreden van1,2,3, stellen wij voor dat de darmen, gal-geïnduceerde biofilm meer voorbijgaande aard is. Dit van voorbijgaande aard, virulente biofilm is hallmarked door een snelle demontage (zoals gezien in de dispersie-assay) en verbeterde virulentie genexpressie waargenomen in de biofilm bevolking4,6. 
Zoals biofilm vorming is een veelzijdige, dynamische proces en het gebruik van galzouten zoals een activerende factor alleen al recent beschreven voor meest darmen ziekteverwekkers, zijn tools en technieken gebruikt unieke en creatieve toepassingen van traditionele methoden. Dus, hier gepresenteerd zijn drie gratis strategieën te kwantificeren van enkele belangrijke kenmerken van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming, met inbegrip van bacteriële aanhankelijkheid, productie van de EPS-matrix, en de dispersie van levensvatbare bacteriën uit de biofilm. Deze technieken hebben gebruikt voornamelijk voor onderzoek met Shigella; en daarom, evaluatie van andere zuurbestendige ziekteverwekkers optimalisatie kan vereisen. Echter positieve gegevens uit alle drie tests ondersteunen identificatie van biofilms en reproduceerbare protocollen voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming stellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilm vorming is een dynamische, meertraps proces dat zich in bacteriën onder strenge milieu-omstandigheden of in tijden van stress voordoet. Voor zuurbestendige ziekteverwekkers, wordt een aanzienlijke stress-respons veroorzaakt gastro-intestinale onderweg en bij gal blootstelling, een normaal onderdeel van menselijke spijsvertering. Om te overwinnen de bactericide effecten van gal, vormen vele darmen ziekteverwekkers een biofilm hypothetische zodat overleven wanneer bij het transitovervoer door de dunne darm. Hier presenteren we methoden om te definiëren van biofilm vorming door naleving van de solid-phase assays evenals extracellulaire polymere stof (EPS) matrix detectie en visualisatie. Bovendien wordt biofilm dispersie beoordeling gepresenteerd waarmee de analyse van gebeurtenissen triggering release van bacteriën tijdens de infectie wordt nagebootst. Kristalviolet kleuring wordt gebruikt voor het detecteren van aanhangend bacteriën in een high-throughput 96-wells-plaat naleving assay. EPS-productie beoordeling wordt bepaald door twee tests, namelijk microscopie kleuring van de EPS-matrix en semi-kwantitatieve analyse met een polysaccharide fluorescently-geconjugeerde bindend lectine. Ten slotte wordt biofilm dispersie gemeten door middel van de graven van de kolonie en beplating. Positieve gegevens uit meerdere tests ondersteunen de karakterisatie van biofilms en kan worden gebruikt om het identificeren van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming in andere bacteriestammen.

In Figuur 1, wordt biofilm vorming veroorzaakt in de meeste van de zes darmen ziekteverwekkers geteste volgende groei in media met galzouten. Een aanzienlijke toename van de aanhangend bacteriën nadat galzouten blootstelling wordt waargenomen in bijna alle stammen getest. De uitzondering is de enteroaggregative E. coli (EGA); nochtans, merken op de geïnduceerde observatie van de Δaaf mutant4. De resultate...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&#39;Bioluminescent&#39; Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Real-time Imaging en kwantificering van schimmel Biofilm ontwikkeling met behulp van een bewerking in twee fasen recirculatie-stroomsysteem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...