Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Gallensalze Medium: um tryptic Soy Bouillon (TSB) mit 0,4 % Gallensalze (Gewicht/Volumen) vorzubereiten, Aufschwemmen 200 mg der Gallensalze in 50 mL autoklaviert TSB. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Wöchentlich machen Sie frisches Medium. Anmerkungen: Die Salze der Gallensäure routinemäßig verwendet, ist eine 1:1 Mischung aus Natrium Cholate und Natrium-Deoxycholate von Schafen und Rindern Gallenblase isoliert. Wie zuvor4gezeigt h...

Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Expe...

Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem eine Kaskade von Ereignissen in Bildung eines ausgereiften anhaftende Bakteriengemeinschaft1,2,3gipfelt. Bakterien produzieren Adhesins um die frühe Bindung während der Verschiebung adhäsin gen expressionsprofile zur Stärkung der Anlage während der Reifung der Biofilm zu erleichtern. Gleichzeitig tritt die EPS-Produktion zu beschichten der Bakteriengemeinschaft in einer Matrix, die Zellen vor den ersten Stressor zu schützen. Der Biofilm enthaltene Bakterien sind langsam wachsend; und als solche die meisten Antibiotika unwirksam macht. Darüber hinaus spart das langsame Wachstum Energie, bis Bedingungen ändern, um bakterielles Wachstum1,2,3bevorzugen. Nach die harten Bedingungen bestanden haben, Bakterien den Biofilm zu zerstreuen und wieder planktonischen Lebensweise1,2,3. Traditionell, Biofilmen auf Oberflächen eingehalten werden und eine anhaltende klinische Herausforderung wegen Infektion Stauseen auf Katheter und in Wohnung Geräte1,2,3vorhanden.
Biofilmbildung wurde kürzlich für mehrere magensaftresistenten Krankheitserreger beschrieben; Bakterien, die den Dünndarm oder Dickdarm4infizieren. Shigella -Arten, tritt Infektion im menschlichen Dickdarm nach einer Durchreise durch die Mehrheit des Magen-Darm-Trakt. Während der Passage durch den Dünndarm ist Shigella Galle ausgesetzt; ein Lipid-abbauenden Waschmittel abgesondert in den Darm zur Verdauung von Lipiden während gleichzeitig töten die meisten Bakterien5zu erleichtern. Enterische Krankheitserregern haben die einzigartige Fähigkeit, die bakterizide Wirkung der Galle6widerstehen. Unsere jüngsten Analyse verwendet in-Vivo-wie Kombinationen aus Glukose und Gallensalze, robuste Biofilmbildung in S. Flexneri demonstrieren sowie anderen Arten von Shigellen, pathogene Escherichia coliund Salmonellen4. Zuvor, Salmonella Enterica Serovar Typhi gezeigt werden konnte, bilden einen Galle-induzierte Biofilm durch einzigartige Besiedlung der Gallenblase während der chronischen Infektion7,8,9, 10. Darüber hinaus vorherige Forschung mit Vibrio11und Campylobacter12 gezeigt Biofilmbildung auf Galle. Daher die Analysen erweitert die Galle-induzierte Biofilm Formation Beobachtungen auf andere Krankheitserreger und helfen, um Demonstration der konservierten magensaftresistenten Erreger Antwort auf Galle zu etablieren. Im Gegensatz zu chronischen Biofilme in der bakteriellen Gentranskription ist begrenzt und Zelle Seneszenz kann auftreten,1,2,3schlagen wir vor, dass der Magensaftresistente Galle-induzierte Biofilm in der Natur mehr vergänglich ist. Diese vorübergehende virulenten Biofilm ist geprägt durch eine schnelle Demontage (gesehen in der Dispersion-Assay) und verbesserte Virulenz Genexpression beobachtet in den Biofilm Bevölkerung4,6. 
Wie Biofilmbildung eine facettenreiche, dynamischer Prozess und die Verwendung von Gallensalzen wie ein auslösende Faktor für die meisten enterischen Krankheitserregern nur vor kurzem beschrieben ist, sind die Werkzeuge und Techniken, die einzigartige und kreative Anwendungen der traditionellen Methoden. So sind die hier vorgestellten drei kostenlose Strategien, mehrere wichtige Eigenschaften der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erwachsenden bakterielle, Produktion von EPS-Matrix und Dispersion von lebensfähigen Bakterien von den Biofilm zu quantifizieren. Diese Techniken wurden in erster Linie für die Forschung mit Shigellagenutzt; und Bewertung der anderen enterischen Krankheitserregern erfordern daher, Optimierung. Dennoch positive Daten aus allen drei Tests unterstützen Identifikation von Biofilmen und reproduzierbare Protokolle für die Galle Salz-induzierte Biofilmbildung einführen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.

In Abbildung 1wird in den meisten der sechs magensaftresistenten Krankheitserreger getestet nach dem Wachstum in Medien, die Salze der Gallensäure Biofilmbildung induziert. Eine deutliche Zunahme der anhaftenden Bakterien nach Gallensalze Exposition in fast allen Stämmen beobachtet wird getestet. Die Ausnahme ist Enteroaggregative E. Coli (EAEC); beachten Sie jedoch die induzierte Beobachtung der Δaaf mutierten...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Mikrotiterschale Biofilmbildung Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisierung von Leukozyten Rollen und Haftung bei Angiotensin II-infundiert Mäusen: Techniken und Fallstricke

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...