Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

אנו מודים חנין B. רייצ'ל, אלחנדרו יאנוס-Chea לקבלת סיוע טכני. אנו מודים אנתוני ט Maurelli, בריאן פ הארלי, אלסיו פאסנו, ברט אי Swierczewski ו בובי Cherayil על זנים השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה K22AI104755 גרנט מחלות זיהומיות (C.S.F.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנת נוגדנים
<ol><li>מלחי מרה בינוני: כדי להכין ציר סויה tryptic (TSB) המכיל מלחי מרה 0.4% (משקל/נפח), resuspend 200 מ ג של מלחי מרה ב 50 מ ל TSB בלוק. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טריים מדי שבוע. הערות: מלחי מרה בשימוש שגרתי הוא תערובת 1:1 של cholate נתרן, סודיום deoxycholate מבודד gallbladders ovine ושור. כפי ש?...

ניתוח של ביופילמים הוא מאתגר בשל אופיו הדינמי של biofilms ולהבדלים בין זנים, חומרים, מעבדות מבחני. . הנה, מספר אסטרטגיות מוצגים כדי לקבוע ביופילמים ב פתוגנים המעית בעקבות חשיפה מלחי מרה עם תובנה ניסיוני הניתנים לקידום הפארמצבטית. ישנם שיקולים נוספים כדי להבטיח הפארמצבטית. בראש ובראשונה, אנו ממ...

ביופילמים היא אסטרטגיית חשוב הישרדות חיידקי הנגרמת במהלך בתנאי סביבה קשים. חשיפה תרכובות אחרים כמו אנטיביוטיקה או שינויים מזין או זמינות חמצן גורם לחוץ בחיידק זה ניתן להקל באמצעות ביופילמים. ממבנה biofilm מאופיין על ידי חיידקי מצורף משטח או חיידקים אחרים, והוא מלווה את הפרשת מטריקס EPS מורכב בעיקר סוכרים1,2,3. ביופילמים הוא תהליך דינמי שבו מפל של אירועים במרקחת היווצרות בוגרת הקהילה חיידקי חסיד1,2,3. החיידקים מייצרים adhesins כדי להקל על קובץ מצורף מוקדם תוך הזזת adhesin ביטוי גנים פרופילים כדי לחזק את הקובץ המצורף במהלך ההבשלה biofilm. במקביל, ייצור EPS מתרחשת את המעיל הקהילה חיידקי במטריצה כדי להגן על התאים מפני הלחץ הראשוני. חיידקים בתוך את biofilm הם לאט גדל; ככזה, יטחנו את רוב אנטיביוטיקה לא יעילה. יתר על כן, הגידול איטי חוסך אנרגיה עד שינוי המצב לטובת התפתחות חיידקים1,2,3. אחרי התנאים הקשים חלפו, חיידקים לפזר את biofilm והמשך חיים פלנקטוניים1,2,3. באופן מסורתי, biofilms הם נצפו על משטחים, מייצגים אתגר קליני מתמשך בשל זיהום המאגרים המצויים על צנתרים ו בדיור התקנים1,2,3.
ביופילמים תוארה לאחרונה מספר גורמים מחוללי המעית; חיידקים להדביק את המעי הדק או הגס4. עבור מינים שיגלה , זיהום מתרחש במעי הגס האנושי לאחר מעבר דרך רוב מערכת העיכול. במהלך המעבר דרך המעי הדק, שיגלה הוא נחשף מרה; חומר משפילים השומנים ניקוי ומופרש אל המעי כדי להקל על עיכול שומנים בזמן בו זמנית להרוג חיידקים רוב5. פתוגנים המעית יכולת ייחודית להתנגד ההשפעות אחרים של מרה6. הניתוח האחרונה שלנו מנוצל vivo-כמו שילובים של גלוקוז ושל מלחי מרה להפגין ביופילמים חזקים ב ס flexneri , כמו גם מינים אחרים של שיגלה, פתוגניים Escherichia coli, ו סלמונלה4. בעבר, סלמונלה enterica serovar Typhi הוצגה כדי ליצור ממבנה biofilm הנוצרות על-ידי המרה עקב קולוניזציה ייחודי של כיס המרה במהלך זיהום כרוני7,8,9, 10. בנוסף, מחקר קודם עם ויבריו11, קמפילובקטר12 הפגינו ביופילמים בתגובה מרה. לכן, הבדיקות מורחב התצפיות היווצרות biofilm מרה-induced פתוגנים אחרים, מסייעות לקיים הפגנה של פתוגן המעית שנשמרת תגובה מרה. בניגוד כרונית biofilms שבו שעתוק גנים חיידקיים מוגבל, הזדקנות ביולוגית התא יכול להתרחש1,2,3, אנו מציעים כי biofilm מרה-induced המעית הוא יותר ארעי בטבע. זה ארעיים, biofilm מידבק ולחתימה על ידי פירוק מהיר (כפי שניתן לראות ב וזמינותו נפיצה), משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה נצפתה ב biofilm האוכלוסייה4,6. 
כמו ביופילמים הוא תהליך דינמי הגיוון הרב והשימוש של מלחי מרה כמו גורם ייזום היה רק תיאר לאחרונה גורמים מחוללי המעית ביותר, הכלים ואת טכניקות המשמשות הם יישומים ייחודיים ויצירתיים של שיטות מסורתיות. כך, המובאים כאן הם שלוש אסטרטגיות ללא תשלום כדי לכמת את מספר מאפיינים חשובים של מלח מרה-induced ביופילמים, כולל חיידקי הדבקות, הפקה של המטריקס EPS, פיזור של חיידקים קיימא מ biofilm. טכניקות אלה כבר נעזרו בעיקר למחקר עם שיגלה; לכן, הערכה של פתוגנים המעית אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. יחד עם זאת, נתונים חיוביים של כל שלושת מבחני תמיכה זיהוי של biofilms ולהקים לשחזור פרוטוקולים עבור מלח מרה-induced ביופילמים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

ביופילמים הוא תהליך דינמי, multistage, המתרחשת אצל חיידקים תחת תנאי סביבה קשים או בזמנים של מתח. עבור המעית פתוגנים, תגובה משמעותית מתח מושרה במהלך ההעברה במערכת העיכול ועל מרה חשיפה, מרכיב נורמלי של מערכת העיכול האנושית. כדי להתגבר על ההשפעות אחרים של מרה, פתוגנים המעית רבים יוצרים ממבנה biofilm המשוערות להתיר הישרדות כאשר הם מגיעים דרך המעי הדק. כאן אנו מציגים מתודולוגיות להגדרת ביופילמים דרך הדבקות מוצק-שלב מבחני וכן זיהוי מטריצה חוץ-תאית חומר פולימריים (EPS) ופריטים חזותיים. יתר על כן, הערכת פיזור biofilm מוצג כדי לחקות את הניתוח של אירועים מפעילה שחרור של חיידקים במהלך תהליך זיהום. קריסטל ויולט מכתים משמש כדי לזהות חיידקים חסיד assay הדבקות תפוקה גבוהה 96-ובכן צלחת. הערכת ייצור EPS נקבעת על-ידי שני מבחני, כלומר מיקרוסקופ מכתים של מטריקס EPS, ניתוח כמותי למחצה עם לקטין איגוד fluorescently מצומדת רב-סוכר. לבסוף, פיזור biofilm נמדדת דרך המושבה ספירות, ציפוי. נתונים חיוביים של מספר מבחני תמיכה אפיון biofilms and יכול להיות מנוצל כדי לזהות מלח מרה-induced ביופילמים בתוך זני חיידקים אחרים.

איור 1, ביופילמים הנגרמת ברוב של הגידול שנבדקו פתוגנים המעית שישה הבאים בתקשורת המכיל מלחי מרה. עלייה משמעותית בחיידקים חסיד לאחר חשיפה מלחי מרה הוא ציין זנים כמעט כל נבדק. החריג הוא enteroaggregative e. coli (EAEC); עם זאת, שים לב התבוננות Δaaf מוטציה<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...