Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Vi takker Rachael B. Chanin og Alejandro Llanos-Chea for teknisk assistanse. Vi takker Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski og Bobby Cherayil for stammene som er brukt i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer Grant K22AI104755 (C.S.F.). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

1. forberedelse av reagenser
<ol><li>Galle salter medium: for å forberede tryptic soya kjøttkraft (TSB) som inneholder 0,4% gallesalter (vekt/volum), resuspend 200 mg av galle salter i 50 mL autoklaveres TSB. Filteret sterilisere bruke filtere 0.22 µm. Gjør frisk medium ukentlig. Merknader: Galle salter som rutinemessig brukes er en 1:1 blanding av natrium cholate og natrium deoxycholate isolert fra ovine og storfe gallbladders. Som vist tidligere4, var tilstedeværelsen av glukose nødve...

Analyse av biofilm formasjon er utfordrende på grunn av dynamikken i biofilm og variasjonen mellom stammer, materialer, laboratorier og analyser. Her presenteres flere strategier for å fastslå biofilm formasjonen i enteric patogener etter galle salter eksponering med eksperimentelle innsikt forsynt for å fremme reproduserbarhet. Det er flere hensyn å sikre reproduserbarhet. Først og fremst, anbefales det at du utfører minst tre uavhengige eksperimenter med teknisk triplicates å bekrefte observasjoner og statistis...

Biofilm dannelsen er en viktig bakteriell overlevelsesstrategi indusert under harde forhold. Eksponering for bakteriedrepende forbindelser som antibiotika eller endringer i næringsstoffer eller oksygen tilgjengelighet induserer en stresset stat i bakterier som kan lindres gjennom biofilm dannelsen. En biofilm er preget av bakteriell vedlegg til en overflate eller andre bakterier og ledsages av utskillelsen av en EPS matrise hovedsakelig består av polysakkarider1,2,3. Biofilm formasjon er en dynamisk prosess der en kaskade av hendelser kulminerer i dannelsen av en moden tilhenger bakterielle samfunnet1,2,3. Bakterien produserer adhesins for å lette tidlig vedlegg skifting av adhesin genet uttrykket profiler for å styrke vedlegg under biofilm modning. Samtidig, slår EPS produksjon strøk den bakterielle samfunnet i en matrise å beskytte cellene fra det første trykk. Bakterier i biofilm er langsom voksende; og som sådan, gjør de fleste antibiotika ineffektive. Videre sparer den langsomme veksten energi til forholdene endres til fordel bakterievekst1,2,3. Etter de harde forholdene har gått, bakterier spre biofilm og gjenoppta en planktoniske livsstil1,2,3. Tradisjonelt biofilm er observert på overflater og en vedvarende klinisk utfordring på grunn av smitte reservoarene på katetre og i-bolig enheter1,2,3.
Biofilm formasjon ble nylig beskrevet for flere enteric patogener; bakterier som smitter tynntarmen eller kolon4. For Shigella arter, oppstår infeksjon i menneskelig kolon etter transitt gjennom fleste gastrointestinaltraktus. Under passasje gjennom tynntarm, er Shigella utsatt for galle; en lipid-nedverdigende vaskemiddel utskilles i tarmen til rette for fordøyelsen av lipider mens samtidig drepe de fleste bakterier5. Innstigning patogener har en unik evne til å motstå bakteriedrepende effekten av galle6. Vår siste analyse benyttet i vivo-liker kombinasjoner av glukose og galle salter å demonstrere robuste biofilm formasjon i S. flexneri og andre arter av Shigella, sykdomsfremkallende Escherichia coliog Salmonella4. Tidligere Salmonella enterica serovar Typhi ble vist å danne en galle-indusert biofilm på grunn av unike kolonisering av gallbladder under kronisk infeksjon7,8,9, 10. i tillegg tidligere forskning med Vibrio11og12 vist biofilm formasjon svar galle. Derfor analysene utvidet galle-indusert biofilm formasjon observasjoner til andre patogener og bidra til å etablere demonstrasjon av bevarte enteric patogen svar til galle. I motsetning til kronisk biofilm som bakteriell genet transkripsjon er begrenset og celle senescence kan oppstå1,2,3, foreslår vi at enteric galle-indusert biofilm er mer midlertidig i naturen. Denne forbigående, virulente biofilm er stemplet av en rask demontering (som sett i spredning analysen) og forbedret virulens genuttrykk observert i biofilm befolkningen4,6. 
Biofilm formasjon er en multifaceted, dynamisk prosess og bruk av galle salter som en initiering faktor har bare vært nylig beskrevet for mest enteric patogener, er verktøy og teknikker som brukes unike og kreative programmer av tradisjonelle metoder. Dermed er presenteres her tre gratis strategier for å kvantifisere flere viktige egenskaper av galle salt-indusert biofilm formasjon, inkludert bakteriell etterlevelse, produksjon av EPS matrix og spredning av levedyktig bakterier fra biofilm. Disse teknikkene har vært benyttet for forskning med Shigella; og derfor evaluering av andre enteric patogener kan kreve optimalisering. Likevel positive data fra alle tre analyser støtter identifikasjon av biofilm og etablere reproduserbar protokoller for galle salt-indusert biofilm formasjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilm formasjon er en dynamisk, flertrinns prosess som skjer i bakterier under harde forhold eller tider med stress. For enteric patogener, er en betydelig stressrespons indusert under gastrointestinal transport og galle eksponering, en normal del av menneskelige fordøyelse. For å overvinne bakteriedrepende effekten av galle, danne mange enteric patogener en biofilm hypotesen for å tillate overlevelse når transitt gjennom tynntarmen. Her presenterer vi metoder for å definere biofilm formasjon gjennom solid-fase tilslutning analyser samt ekstracellulære polymere stoff (EPS) matrix gjenkjenning og visualisering. Videre er biofilm spredning vurdering presentert for å etterligne analyse av hendelser utløse utgivelsen av bakterier under infeksjon prosessen. Crystal violet flekker brukes til å oppdage tilhenger bakterier i en høy gjennomstrømming 96-brønns plate overholdelse av analysen. EPS produksjon vurdering bestemmes av to analyser, nemlig mikroskopi farging av EPS matrise og semi kvantitativ analyse med en fluorescently-konjugerte polysakkarid bindende Lektiner. Endelig måles biofilm spredning gjennom kolonien teller og plating. Positive data fra flere analyser støtte karakterisering av biofilm og kan brukes til å identifisere galle salt-indusert biofilm formasjon i andre bakterielle stammer.

I figur 1, er biofilm formasjon indusert i de fleste av seks enteric patogener testet følgende vekst i media som inneholder galle salter. En betydelig økning i tilhenger bakterier etter galle salter eksponering er observert i nesten alle stammer testet. Unntaket er enteroaggregative E. coli (EAEC); men oppmerksom indusert observasjon av Δaaf mutant4. Resultatene indikerer at ytterligere tilslutning mekani...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Denne protokollen gjør leseren til å analysere galle salt-indusert biofilm formasjonen i enteric patogener med en mangefasettert tilnærming for å fange dynamikken i bakteriell biofilm ved å vurdere etterlevelse, ekstracellulære polymere stoff matrix formasjon, og spredning.

Galle Salt-indusert Biofilm formasjonen i Enteric patogener: teknikker for identifikasjon og måling

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Bruke Fluorescent Proteiner til Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanske Trypanosom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifisering av sjeldne bakterielle patogener av 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Kvantifisering av Monocyte Transmigration og skum celle formasjon fra personer med kronisk opphissende vilkårene

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisere leukocytter rullende og vedheft i Angiotensin II-tilført mus: teknikker og fallgruver

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Sanntid bildebehandling og kvantifisering av sopp Biofilm utvikling bruker en tofaset resirkulerende med System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...