Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Agradecemos a Rachael B. Chanin y Alejandro Llanos-Chea para asistencia técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski y Bobby Cherayil para las cepas utilizadas en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y K22AI104755 de subvención de enfermedades infecciosas (C.S.F.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

1. preparación de reactivos
<ol><li>Medio de las sales biliares: para preparar el caldo de soja tríptica (TSB) que contiene las sales biliares 0,4% (peso/volumen), resuspender 200 mg de las sales biliares en 50 mL esterilizado TSB. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco cada semana. Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente es una mezcla de 1:1 de colato sódico y desoxicolato de sodio aislado de las vesículas ovinas y bovinas. Como demostrado anteriormente<sup class="...

Análisis de la formación de biofilm es un reto debido a la naturaleza dinámica de biofilms y la variabilidad entre cepas, materiales, laboratorios y ensayos. Aquí, se presentan varias estrategias para determinar la formación de biopelículas en patógenos entéricos después de la exposición de las sales biliares con conocimiento experimental para promover la reproducibilidad. Hay consideraciones adicionales para asegurar la reproducibilidad. Ante todo, recomendamos realizar independiente por lo menos tres experime...

Formación de biofilms es una estrategia importante de supervivencia bacteriana inducida durante duras condiciones ambientales. Exposición a compuestos bactericidas como antibióticos o cambios en los nutrientes o la disponibilidad de oxígeno induce un estado de estrés en las bacterias que pueden ser aliviadas a través de la formación de biopelículas. Una biopelícula se caracteriza por el accesorio de bacteria a una superficie o a otras bacterias y se acompaña de la secreción de la matriz de EPS conformada principalmente por polisacáridos1,2,3. Formación de biopelículas es un proceso dinámico en el que una cascada de eventos culmina en la formación de una comunidad bacteriana adherente madura1,2,3. Las bacterias producen adhesinas para facilitar el apego temprano mientras cambio de perfiles de expresión génica de adhesina para fortalecer el apego durante la maduración de la biopelícula. Al mismo tiempo, ocurre la producción de EPS para cubrir la comunidad bacteriana en una matriz para proteger las células contra el estresor inicial. Bacterias dentro del biofilm son de crecimiento lento; y como tal, la mayoría antibióticos ineficaces. Además, el lento crecimiento conserva energía hasta que las condiciones cambien para favorecer el crecimiento bacteriano1,2,3. Después de las duras condiciones, las bacterias dispersan el biofilm y reanudar un estilo de vida planctónica1,2,3. Tradicionalmente, los biofilms se observan en las superficies y representan un desafío clínico persistente debido a depósitos de infección en catéteres y en la vivienda aparatos1,2,3.
Formación de biofilms fue descrita recientemente por varios patógenos entéricos; bacterias que infectan el intestino delgado o colon4. Para las especies de Shigella , la infección ocurre en el colon humano después de un tránsito a través de la mayoría del tracto gastrointestinal. Durante el paso por el intestino, Shigella se expone a la bilis; un detergente de degradar lípidos secretado en el intestino para facilitar la digestión de lípidos mientras que simultáneamente mata la mayoría de las bacterias5. Patógenos entéricos tienen una capacidad única de resistir los efectos bactericidos de bilis6. Nuestro análisis recientes utilizaron en vivo-como combinaciones de glucosa y las sales biliares para demostrar formación de biofilm robusto en S. flexneri , así como otras especies de patógenos Shigella, Escherichia coliy Salmonella4. Previamente, Salmonella enterica serovar Typhi fue demostrado para formar un biofilm inducida por bilis debido a la colonización única de la vesícula biliar durante la infección crónica7,8,9, 10. Además, investigaciones previas con Vibrio11y Campylobacter12 demostraron la formación de biofilm en respuesta a la bilis. Por lo tanto, los análisis amplió las observaciones de la formación de biofilm inducida por bilis a otros patógenos y ayudan a establecer la demostración de una respuesta patógeno entérico conservado a bilis. A diferencia de la crónica biofilms que transcripción genética bacteriana limitada y senescencia celular puede ocurrir1,2,3, proponemos que el biofilm inducida por bilis entérico es más transitorio en naturaleza. Este transitorio, biofilm virulento se caracteriza por un desmontaje rápido (como se ve en el análisis de dispersión) y una mayor expresión de genes de virulencia en la biopelícula población4,6. 
Formación de biopelículas es un proceso multifacético, dinámico y el uso de las sales biliares como un factor de iniciación sólo ha sido recientemente descrito por patógenos entéricos más, las herramientas y técnicas utilizadas son únicas y creativas aplicaciones de los métodos tradicionales. Por lo tanto, aquí se presentan tres estrategias gratuitas para cuantificar varias características importantes de la formación de biofilm inducida por sales biliares, incluyendo la adherencia bacteriana, producción de la matriz EPS y la dispersión de bacterias viables del biofilm. Estas técnicas se han utilizado principalmente para la investigación con Shigella; y por lo tanto, la evaluación de otros patógenos entéricos puede requerir optimización. Sin embargo, datos positivos de los tres ensayos apoyan identificación de biofilms y establecen protocolos reproducibles para la formación del biofilm inducida por sales biliares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Formación de biopelículas es un proceso dinámico y gradual que se produce en bacterias bajo condiciones ambientales difíciles o momentos de estrés. Para patógenos entéricos, se induce una respuesta de estrés importante durante el tránsito gastrointestinal y a la exposición de la bilis, un componente normal de la digestión humana. Para superar los efectos bactericidos de la bilis, muchos patógenos entéricos forman una biopelícula que se presumen para permitir sobrevivir al tránsito por el intestino. Aquí presentamos metodologías para definir la formación de biopelículas a través de ensayos de fase sólida adherencia así como detección de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y visualización. Además, se presenta evaluación de dispersión de biofilm para imitar el análisis de eventos desencadenar liberación de bacterias durante el proceso de infección. Tinción de cristal violeta se utiliza para detectar bacterias adherentes en un ensayo de adherencia de la placa de 96 pozos de alto rendimiento. Evaluación de producción de EPS está determinada por dos ensayos, a saber, microscopía de tinción de la matriz EPS y análisis semicuantitativo con una lectina de polisacárido conjugado fluorescente. Por último, dispersión de biofilm se mide a través de recuentos de colonias y chapado. Datos positivos de ensayos múltiples apoyan la caracterización de biopelículas y pueden ser utilizados para identificar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en otras cepas bacterianas.

En la figura 1, formación de biopelículas se induce en la mayor parte del crecimiento siguiente prueba seis patógenos entéricos en medios que contienen sales biliares. Un aumento significativo de bacterias adherentes después de la exposición de las sales biliares se observa en casi todas las cepas probadas. La excepción es enteroaggregative e. coli (CEEA); sin embargo, tenga en cuenta la observación inducida de los mutantes de la<em...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Este protocolo permite al lector a analizar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos usando un enfoque multifacético para capturar la naturaleza dinámica de los biofilms bacterianos mediante la evaluación de adherencia, formación de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares, y de dispersión.

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Plato de microtitulación de formación de biopelículas de ensayo

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Investigación

Inmunología e Infección

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Cuantificación de transmigración de monocitos y formación de la célula de la espuma de individuos con enfermedades inflamatorias crónicas

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...