Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Vi tackar Rachael B. Chanin och Alejandro Llanos-Chea för tekniskt bistånd. Vi tackar Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski och Bobby Cherayil för de stammar som används i denna studie. Detta arbete stöds av det nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar Grant K22AI104755 (C.S.F.). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

1. beredning av reagens
<ol><li>Gallsalter medium: för att förbereda tryptic soy buljong (TSB) som innehåller 0,4% gallsalter (vikt/volym), Återsuspendera 200 mg av gallsalter i 50 mL Ånghärdad TSB. Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Se färska medium varje vecka. Anteckningar: Gallsalter som rutinmässigt används är en 1:1 blandning av natrium cholate och natriumdeoxikolat isolerade från får och nötkreatur gallbladders. Som visat tidigare4, krävdes förekomst av glukos för ...

Analys av biofilm bildning är utmanande på grund av den dynamiska karaktären av biofilmer och variabiliteten mellan stammar, material, laboratorier och testmetoder. Här presenteras flera strategier för att fastställa biofilm bildning i enteriska patogener efter gallsalter exponering med experimentella insikt för att främja reproducerbarhet. Det finns ytterligare överväganden att säkerställa reproducerbarhet. Först och främst rekommenderar vi utför minst tre oberoende experiment med tekniska exemplar att be...

Biofilm bildning är ett viktigt bakteriell överlevnadsstrategi inducerad under svåra miljöförhållanden. Exponering för bakteriedödande föreningar som antibiotika eller förändringar i näringsämne eller syre tillgänglighet inducerar ett stressat tillstånd i bakterier som kan lindras genom biofilm bildning. En biofilm kännetecknas av bakteriell fäste på en yta eller andra bakterier och åtföljs av utsöndringen av en EPS matris huvudsakligen består av polysackarider1,2,3. Biofilm bildning är en dynamisk process där en kaskad av händelser kulminerar i bildandet av en mogen vidhäftande bakteriell gemenskapen1,2,3. Bakterier producerar adhesiner för att underlätta tidig fastsättning medan skiftande adhesin gen uttryck profiler för att stärka fastsättning under biofilm mognad. Samtidigt uppstår EPS produktion till pälsen en matris bakteriell gemenskapen att skydda celler från den inledande stressfaktor. Bakterier som finns i biofilmen är långsamt växande; och som sådan gör de flesta antibiotika ineffektiva. Dessutom sparar den långsamma tillväxten energi tills förutsättningarna förändras för att gynna bakterietillväxt1,2,3. Efter de hårda villkoren har passerat, bakterier skingra biofilmen och återuppta en plankton livsstil1,2,3. Traditionellt biofilmer observeras på ytor och representerar en ihållande kliniska utmaning på grund av infektion reservoarer på katetrar och i-bostad enheter1,2,3.
Biofilm bildning beskrevs nyligen för flera enteriska patogener. bakterier som infekterar tunntarmen eller tjocktarmen4. För Shigella arterna, uppstår infektion i människors kolon efter en transitering genom majoriteten av mag-tarmkanalen. Under passagen genom tunntarmen, är Shigella utsatt för galla; ett lipid-förnedrande rengöringsmedel som utsöndras till tarmen att underlätta matsmältningen av lipider medan samtidigt dödar de flesta bakterier5. Enteriska patogener har en unik förmåga att motstå de bakteriedödande effekten av galla6. Vår senaste analys utnyttjas i vivo-gillar kombinationer av glukos och gallsalter att demonstrera robusta biofilm bildning i S. flexneri samt andra arter av Shigella, patogena Escherichia colioch Salmonella4. Tidigare, Salmonella enterica serovar Typhi visades att bilda en galla-inducerad biofilm på grund av unika koloniseringen av gallblåsan under kronisk infektion7,8,9, 10. Dessutom tidigare forskning med Vibrio11och Campylobacter12 visat biofilm bildning svar på galla. Därför analyser extended galla-inducerad biofilm bildning observationerna andra patogener och bidra till att upprätta demonstration av ett bevarat enteriska patogener svar på galla. Till skillnad från kronisk biofilmer där bakteriell gentranskription är begränsad och cellen åldras kan förekomma1,2,3, föreslår vi att den enteriska galla-inducerad biofilmen är mer övergående. Detta övergående, virulenta biofilm är tillverkas av en snabb demontering (som sett i dispersion-analysen) och förbättrad virulens genuttryck hos biofilm befolkningen4,6. 
Biofilm bildning är en mångsidig, dynamisk process och användning av gallsalter som en inledande faktor har endast nyligen beskriven för mest enteriska patogener, är de verktyg och tekniker som används unika och kreativa program av traditionella metoder. Därför är presenteras här tre gratis strategier att kvantifiera flera viktiga egenskaper hos galla salt-inducerad biofilm bildning, inklusive bakteriell vidhäftning, produktion av EPS-matrisen och spridning av livskraftiga bakterier från biofilmen. Dessa tekniker har använts främst för forskning med Shigella; och utvärdering av andra enteriska patogener kan därför kräva optimering. Trots positiva data från alla tre analyser stödja identifiering av biofilmer och upprätta reproducerbara protokoll för galla salt-inducerad biofilm bildning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilm bildning är en dynamisk, flerstegs process som sker i bakterier under svåra miljöförhållanden eller tider av stress. För enteriska patogener induceras en betydande stress svar under gastrointestinal transit och vid galla exponering, en normal del av mänskliga matsmältningen. För att övervinna de bakteriedödande effekten av galla, bildar många enteriska patogener en biofilm som hypotes för att tillåta överlevnad när transiteras genom tunntarmen. Här presenterar vi metoder för att definiera biofilm bildning genom fasta fasen följsamhet analyser samt extracellulära polymera ämne (EPS) matrix upptäckt och visualisering. Dessutom presenteras biofilm dispersion bedömning för att efterlikna analys av händelser som utlöser frisättning av bakterier under infektionsprocessen. Kristallviolett färgning används för att upptäcka vidhäftande bakterier i en hög genomströmning plattan med 96 brunnar följsamhet-analys. EPS-produktion bedömning bestäms av två analyser, nämligen mikroskopi färgning av EPS-matrisen och semikvantitativ analys med en fluorescently-konjugerad polysackarid bindning lectin. Slutligen, biofilm dispersion mäts genom kolonin räknas och plätering. Positiva data från flera analyser stöder karakterisering av biofilmer och kan användas för att identifiera galla salt-inducerad biofilm bildning i andra bakteriestammar.

I figur 1induceras biofilm bildning i de flesta av sex enteriska patogener testade följande ökningen av media som innehåller gallsalter. En betydande ökning av vidhäftande bakterier efter gallsalter exponering observeras i nästan alla stammar testade. Undantaget är enteroaggregative E. coli (Euratom); dock notera inducerad observationen av Δaaf mutant4. Resultaten tyder på att ytterligare följsamhe...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Detta protokoll gör det möjligt för läsaren att analysera galla salt-inducerad biofilm bildning i enteriska patogener använder en mångfacetterad strategi för att fånga den dynamiska karaktären av bakteriell biofilm genom att bedöma följsamhet, extracellulära polymera substansen matrisen bildande, och spridning.

Bile Salt-inducerad Biofilm bildning i enteriska patogener: tekniker för identifiering och kvantifiering

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Mikroteststrips Dish biofilm bildning analys

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilm bildning i en 8-brunnars avdelningen Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; Reporter Phage för detektion av kategori A mängden sjukdomsalstrande bakterier

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifiering av sällsynta mängden sjukdomsalstrande bakterier från 16S rRNA Gene sekvensering och MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Kvantifiering av monocyt själavandring och skum Cell Formation från individer med kroniska inflammatoriska sjukdomar

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Visualisera leukocyt rullande och vidhäftning i Angiotensin II-infusion möss: tekniker och fallgropar

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Realtid avbildning och kvantifiering av svamp Biofilm utveckling med hjälp av en tvåfas recirkulerande flödessystem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...