Name: preparation, purification, and use of fatty acid-containing liposomes
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes at JoVE.com

J.W.S. est un enquêteur du Howard Hughes Medical Institute. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention (290363) de la Fondation Simons à J.W.S. A.E.E. tant K.P.A. souligner le soutien des fonds de démarrage de l’Université du Minnesota.

<ol>
	<li>Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Models+of+Primitive+Cellular+Compartments:+Encapsulation,+Growth,+and+Division.">Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division.</a> Science. 302, 618-622 (2003).</li><li>Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tob&#233;, S., Da Treco, ., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+synthesis+of+a+genetic+polymer+in+a+model+protocell.">Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell.</a> Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).</li><li>Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+vesicles+of+monocarboxylic+acids+and+alcohols:+conditions+for+stability+and+for+the+encapsulation+of+biopolymers.">Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).</li><li>Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autopoietic+Self-Reproduction+of+Fatty+Acid+Vesicles.">Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).</li><li>Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Synthesis+of+Oligoadenylates+on+a+Polyuridylic+Acid+Template.">Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+template-directed+RNA+synthesis+inside+model+protocells.">Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+catalytic+oligoribonucleotide.">A small catalytic oligoribonucleotide.</a> Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).</li><li>Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+catalysis+in+model+protocell+vesicles.">RNA catalysis in model protocell vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).</li><li>Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+between+primitive+cell+membranes+and+soluble+catalysts.">Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts.</a> Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).</li><li>Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Template-directed+Synthesis+on+Random+Copolymers.">RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers.</a> J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).</li><li>Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+liposome+dialyzer+for+the+preparation+of+high-value,+small-volume+liposome+formulations.">Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations.</a> Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+large+monodisperse+vesicles.">Preparation of large monodisperse vesicles.</a> PloS one. 4 (4), e5009 (2009).</li><li>Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+extrusion+through+polycarbonate+track-etched+membranes+using+a+hand-held+mini-extruder.">Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder.</a> Methods Enzym. 533, (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Liposomes formés à partir des acides gras ont été suggérées par beaucoup comme des modèles potentiels pour des cellules primitives en raison de leur haute perméabilité et les propriétés dynamiques. Le groupe de tête carboxylique des acides gras à chaîne unique ne permet auto-assemblage dans les membranes dans une gamme restreinte de pH, et les membranes qui en résultent sont très sensibles à la présence de sels. Ainsi, les vésicules acides gras nécessitent différente préparation et manipulation des méthodes par rapport à des vésicules phospholipidiques.
Dans ce protocole, même si nous utilisons l’acide oléique à titre d’exemple pour la formation de liposomes, autre longue chaîne des acides gras insaturés (C14) et leurs dérivés (ca. acide myristoléique, acide palmitoléique et les alcools correspondants et des esters de glycérol) constituent également des vésicules suivant la méthode de réhydratation de minces tant que la concentration de lipides totaux est au-dessus de la cmc et le pH tampon hydratation se trouve à proximité de la pKa des acides gras au sein de la membrane. Autre que tampon tris-HCl utilisé dans le présent protocole, autres systèmes tampon (ca. bicine, phosphate, borate) ont été signalés à soutenir la formation de vésicules acides gras, si vésicules formées dans un tampon phosphate ou borate sont habituellement très perméables13. Les vésicules acides gras qui en résulte après réhydratation sont polydispersés et multilamellaires, mais sont facilement converti en vésicules unilamellaires petit monodispersés par extrusion, tel que décrit. Comparé à sonication comme une méthode alternative pour générer de petites vésicules, extrusion offre plus d’options pour le contrôle de la taille de la vésicule en appliquant les membranes de taille de pore différente. Vésicules après extrusion sont généralement légèrement plus grands que la taille des pores membranaires, mais en augmentant le nombre de cycles d’extrusion, avec une granulométrie plus étroite et une taille moyenne proche de taille des pores de la membrane des vésicules peuvent être obtenus.
Pour synthétiser protocells fonctionnelle, vésicules acides gras doivent les réactions biochimiques spécifiques hôte résultant de l’encapsulation d’ARN ou d’autres blocs de construction. La méthode de réhydratation minces fournit un moyen facile de vésicules de forme contenant des matériaux encapsulés désirées. Cependant, l’efficacité d’encapsulation est relativement faible et une grande partie des matériaux précieux tels que RNA sont généralement perdues pendant le processus de purification. Dans certains cas l’efficacité de l’encapsulation peut être légèrement améliorée par cycles de gel-dégel répétés avant extrusion. Microfluidique de méthodes pour la préparation de rendement élevé de liposomes de phospholipides permettent presque efficacité d’encapsulation de 100 %, mais des méthodes analogues n’ont pas encore été développés pour vésicules acides gras.
Quelle manipulation protocells avec chélatés ou libre Mg2 +, purification après addition de solution de magnésium et repurification avant chaque instant assure l’enlèvement de fuite encapsulé matériel susceptibles d’affecter la précision de la vitesse de réaction mesures à l’intérieur des vésicules. Puisque chaque purification prend au moins 10 min pour atteindre la bonne séparation et collecter des fractions de la vésicule, l’analyse des réactions rapides est difficile, et la réaction doit être arrêtée avant la repurification de la colonne.
Le protocole que nous présentons ici est bien adapté pour la construction des liposomes d’acide gras qui hébergent des réactions imitant ceux qui pourraient se produire dans les cellules primitives. Nos protocoles permettent également des applications potentielles dans le développement de systèmes biomédicaux et autres réactions biochimiques les bioréacteurs.

Liposomes ou vésicules – compartiments délimitées par des membranes de bicouche composés de lipides amphiphiles - ont trouvé usage dans de nombreuses applications biomédicales, comme véhicules de livraison pour les produits pharmaceutiques, les modèles des membranes cellulaires et pour le développement du synthétique cellules. Nous et autres avons également employé des liposomes comme modèles de membranes de cellules primitives en début de vie. 1 , 2 , 3 , 4 en règle générale, dans ces systèmes, nous employons amphiphiles chaîne unique contenant la queue d’hydrocarbure de lipides qu’une seule (par exemple, l’acide oléique), que ces molécules sont plus simples à synthétiser sans le bénéfice des enzymes des protéines codées cellules modernes emploient.
Liposomes composés de lipides de chaîne unique sont semblables à ceux formés à partir de diacylphospholipids (p. ex., 1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine ou POPC) car la limite est constituée de membranes bicouches. Liposomes formés de deux classes de lipides peuvent retenir une charge dissoute et peuvent être réduits et purifiées par différentes techniques. Plusieurs différences importantes résultent les caractéristiques chimiques des lipides de chaîne unique. Vésicules, formés par des phospholipides sont stables sur une plage de pH large, tandis que les vésicules acides gras ne sont pas stables à pH neutre à légèrement base (ca. 7-9), qui exige certaines tampon de pH pour la préparation de la vésicule. La plupart du temps, ce tampon peut également contenir des molécules solubles spécifiques pour l’encapsulation de vésicules, qui peut être soit matériaux fonctionnels (p. ex., RNA) pour les réactions biochimiques compartimentées ou des colorants fluorescents simples (p. ex., calcéine ) pour la caractérisation de la vésicule.
La présence d’une chaîne unique d’hydrocarbures produit une membrane qui est plus perméable aux solutés, tant que plus dynamique. En outre, le groupe acide carboxylique tête présent dans les résultats des acides gras dans les vésicules qui sont plus sensibles à la présence de cations divalents et de sels (p. ex., Mg2 +). Le magnésium est un des plus importantes cations divalents pour catalyser des réactions biochimiques dans protocells pour les études de l’origine de la vie. Au début de la vie, avant l’évolution des enzymes de protéines sophistiqué, RNA peut avoir été le polymère dominant, en raison de sa double capacité à se répliquer et d’effectuer de catalyse. Un exemple représentatif d’un ARN nécessitant de magnésium associés réaction est non enzymatiques ARN copie, la première fois dans les années 1960. 5 lorsque les nucléotides de RNA chimiquement activés (c.-à-d. les nucléotides 2-methylimidazolide) lient à un complexe amorce-modèle préexistant, le groupe hydroxyle en 3' de l’apprêt attaque la 5'-phosphate d’un monomère activé adjacent à déplacer le groupe (c'est-à-dire 2-méthylimidazole) laissant et formes un nouveau phosphodiester bond. Cette chimie copie RNA exige une forte concentration de Mg2 +, qui doit être chélaté pour être compatible avec les acides gras protocells. 6 un autre Mg2 +-dépendante réaction est catalysé par le ribozyme hammerhead, qui est peut-être l’ARN catalytique mieux caractérisé. Cette ribozyme, qui peut être reconstitué à partir de deux courts oligonucléotides, effectue une réaction auto-clivage qui est pratique pour surveiller par un décalage de gel. Par conséquent, il est fréquemment employé comme un ribozyme de modèle dans les études de l’origine de la vie. 7 en raison d’une exigence de cette ribozyme aboutissent magnésium, liposomes sont généralement construits par un mélange d’acides gras et esters de glycérol d’acides gras, qui sont plus stables au magnésium. 8 , 9 dans le présent protocole, nous présentons les techniques nous ont mis au point pour la préparation, la manipulation, la caractérisation de ces vésicules et démontrer l’application de ces vésicules protocells à l’hôte non enzymatique RNA copie et marteau ribozyme catalyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>sephorose 4B</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>4B200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>C0875-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-HCl pH8.0 1M</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td>
			<td>AM9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>71690-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oleic acid</td>
			<td>Nu-Chek</td>
			<td>U-46-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol monooleate</td>
			<td>Nu-Chek</td>
			<td>M-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss Rhodamine-PE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td>
			<td>L1392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride</td>
			<td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequagel concentrate</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequagel DILUENT</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-UREA GEL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC68852BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titon-100x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA template</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hammerhead substrate strand</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hammerhead ribozyme strand</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vesicle extruder set</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fraction collector</td>
			<td>Gilson, Inc.</td>
			<td>171041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9995941/675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax i3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon A1R MP Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Typhoon 9410 scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, purification, and use of fatty acid-containing liposomes

Liposomes contenant la chaîne unique amphiphiles, particulièrement les acides gras, présentent des propriétés distinctes par rapport à ceux contenant du diacylphospholipids en raison des propriétés chimiques uniques de ces amphiphiles. En particulier, les liposomes d’acide gras améliorent caractère dynamique, en raison de la solubilité relativement élevée de la chaîne unique amphiphiles. De même, les liposomes contenant des acides gras libres sont plus sensibles aux cations divalents et de sels, en raison de l’interaction forte entre l’acide carboxylique groupes de tête et les ions métalliques. Ici, nous illustrons techniques de préparation, de purification et utilisation des liposomes, composé en partie ou totalité d’amphiphiles seule chaîne (par exemple, les acides oléique).

Généralement, nous effectuons des purifications liposome sur colonnes d’exclusion stérique. Liposome typique préparations contiennent un fluorophore quelconque. Lorsque les liposomes sont générées et extrudés, l’espèce doit être encapsulée est présente à l’intérieur et à l’extérieur les liposomes. Par épuration des liposomes sur une résine d’exclusion stérique (Sépharose 4 b), des solutés capsulées sont retenues dans les pores de la résine, tandis que les liposomes plus gros ne sont pas et Éluer la première (Figure 1 a). Rassemblant des fractions et le tracé de fluorescence par rapport au nombre de fraction (Figure 1 b) en général donne une trace de deux de pointe, avec les fractions à élution de début correspondant aux liposomes, qui sont ensuite collectés et utilisés dans des applications ultérieures.
Nous examinons fréquemment des réactions non-enzymatique primer extension, qui constituaient un moyen susceptible de réplication RNA avant l’émergence des ribozymes et axée sur la protéine ARN polymérases. Ces réactions emploient généralement un apprêt fluorescent étiqueté (Figure 2 a), qui s’étend de monomères activés. Ces réactions peuvent être surveillées par électrophorèse sur gel (Figure 2 b) et la résultante électrophérogrammes intégrée pour obtenir les constantes de vitesse pour un État donné de réaction (Figure 2).
Pour démontrer que RNA pouvait fonctionner à l’intérieur de la protocells, nous employons hammerhead ribozyme self-clivage (Figure 3 a) comme une réaction catalytique de RNA de modèle. Cette réaction nécessite gratuit Mg2 + à la catalyse, et c’est pourquoi nous avons utilisé des vésicules OA/OGM puisqu’ils sont plus stables en présence de 5 mM Mg2 +. Similaires aux réactions d’extension amorce, la réaction de self-clivage de ribozyme hammerhead peut également être surveillées par électrophorèse sur gel (Figure 3 b) et plus tard analysées afin d’acquérir la constante de vitesse dans des conditions particulières (Figure 3).
Nous avons l’image liposomes qui emploient les deux fluorescence et diascopie. Liposomes peuvent être étiquetés à l’aide de lipides fluorescents, qui donnent une étiquette de membrane (Figure 4 a), ou un soluté fluorescent dans leur lumière (Figure 4 b). Lumière transmise permet également d’observer les vésicules (également illustrées dans la Figure 4 b).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tableau 1.1 d’acide oléique pur dans le chloroforme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>Stock</td>
			<td>Montant</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique</td>
			<td>> 99 %</td>
			<td>11,7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Chloroforme</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tableau 1.2 acide oléique et monooléate de glycérol (9:1) dans le chloroforme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>Stock</td>
			<td>Montant</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique</td>
			<td>> 99 %</td>
			<td>10.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Monooléate de glycérol</td>
			<td>> 99 %</td>
			<td>1,4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Chloroforme</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique tableau 1.3 avec 0.2mol% Rhodamine-PE dans le chloroforme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>Stock</td>
			<td>Montant</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique</td>
			<td>> 99 %</td>
			<td>1,6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rhodamine-PE dans le chloroforme</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Chloroforme</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Solutions de chloroforme de l’acide gras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg"> Figure 1. Vésicule purification et fluorescence caractérisation de la fraction de la purification. A. séparation des vésicules contenant de calcéine de calcéine gratuit sur une colonne de Sépharose 4 b. B. vésicule et détection de pics de calcéine gratuit en traçant la fluorescence dans chaque puits par rapport au nombre bien après la collecte de la fraction. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg"> Figure 2. Réplication de RNA non enzymatique à l’intérieur de vésicules OA. A. schéma d’extension d’amorce RNA non enzymatiques. B. les image de PAGE d’une réaction d’extension amorce à l’intérieur de vésicules d’acide oléique pur, aux conditions qu’à l’article 4. C. linéaire ajustement du logarithme naturel du ratio de quantité d’apprêt reste au compte tenu du point dans le temps du montant initial de primer vs temps plus 30 h Vitesse de réaction, calculée à partir de la pente du temps de vs ln (P/P,0), est 0,058 h-1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg"> Figure 3. Clivage de ribozyme Hammerhead dans les vésicules OA/OGM. A. plan de clivage ribozyme hammerhead du brin de substrat fluorescent étiquetés (en haut). B. image de la PAGE du clivage ribozyme hammerhead à l’intérieur de vésicules OA/OGM avec 5 mM Mg2 +. C. Ribozyme activité à l’intérieur des vésicules. Ajustement linéaire du logarithme naturel du ratio de quantité de substrat restant au compte tenu du point dans le temps à la quantité de substrat / temps en h 4 première réaction initiale taux, calculé à partir de la pente du temps vs de ln (s/s,0), est de 0,36 h-1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg"> Figure 4. Vésicules de géant des acides gras pour la microscopie. A. image de microscopie confocale d’un PE de Rhodamine étiqueté acide oléique vésicule, échelle bar 10 μm. B. image de microscopie confocale d’acide oléique vésicule contenant Alexa488 étiqueté RNA avec membrane montré dans le canal de transmission détecteur (TD), échelle bar 5 μm.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes at JoVE.com

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes contenant la chaîne unique amphiphiles, particulièrement les acides gras, présentent des propriétés distinctes par rapport à ces diacylphospholipids contenant en raison des propriétés chimiques uniques de la seule chaîne amphiphiles. Nous décrivons ici les techniques de préparation, purification et utilisation des liposomes, composé en partie ou totalité de ces amphiphiles.

Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

L&#39;utilisation de cellules souches humaines périvasculaires pour la régénération osseuse

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Recherche

Bio-ingénierie

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Spécialement conçu à base de laser appareils de chauffage à libération déclenchée de cisplatine de thermosensible liposomes avec guidage par l&#39;image par résonance magnétique

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Utilisation de la tomographie calculée par rayons X micro avec préparation d'acide phosphotungstic pour visualiser le tissu fibromusculaire humain

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Production microfluidique de liposomes sensibles à la température contenant des lysolipides

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...