Name: preparation, purification, and use of fatty acid-containing liposomes
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes at JoVE.com

J.W.S. הוא חוקר במכון רפואי הווארד יוז. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק (290363) של הקרן סימונס J.W.S. הן A.E.E. והן K.P.A. מכיר בכך תמיכה מקרנות הפעלה אוניברסיטת מינסוטה.

<ol>
	<li>Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Models+of+Primitive+Cellular+Compartments:+Encapsulation,+Growth,+and+Division.">Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division.</a> Science. 302, 618-622 (2003).</li><li>Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tob&#233;, S., Da Treco, ., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+synthesis+of+a+genetic+polymer+in+a+model+protocell.">Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell.</a> Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).</li><li>Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+vesicles+of+monocarboxylic+acids+and+alcohols:+conditions+for+stability+and+for+the+encapsulation+of+biopolymers.">Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).</li><li>Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autopoietic+Self-Reproduction+of+Fatty+Acid+Vesicles.">Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).</li><li>Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Synthesis+of+Oligoadenylates+on+a+Polyuridylic+Acid+Template.">Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+template-directed+RNA+synthesis+inside+model+protocells.">Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+catalytic+oligoribonucleotide.">A small catalytic oligoribonucleotide.</a> Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).</li><li>Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+catalysis+in+model+protocell+vesicles.">RNA catalysis in model protocell vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).</li><li>Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+between+primitive+cell+membranes+and+soluble+catalysts.">Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts.</a> Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).</li><li>Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Template-directed+Synthesis+on+Random+Copolymers.">RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers.</a> J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).</li><li>Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+liposome+dialyzer+for+the+preparation+of+high-value,+small-volume+liposome+formulations.">Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations.</a> Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+large+monodisperse+vesicles.">Preparation of large monodisperse vesicles.</a> PloS one. 4 (4), e5009 (2009).</li><li>Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+extrusion+through+polycarbonate+track-etched+membranes+using+a+hand-held+mini-extruder.">Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder.</a> Methods Enzym. 533, (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ליפוזומים של חומצות שומן שהוצעו על ידי רבים דגמים פוטנציאליים עבור תאים פרימיטיביים בשל שלהם חדירות גבוהה ואת מאפייני דינמי. קבוצת ראש קרבוקסילית של חומצות שומן שרשרת אחת בלבד מאפשר הרכבה עצמית תוך ממברנות בטווח מוגבל pH, בקרום וכתוצאה מכך די רגישים לנוכחות של מלחי. כתוצאה מכך, חומצת שומן שלפוחית דורשים הכנה שונה וטיפול בשיטות לעומת פוספוליפיד שלפוחית.
ב פרוטוקול זה, שלמרות שאנו משתמשים חומצה אולאית כדוגמה עבור ליפוזום היווצרות, השני שרשרת חומצות שומן בלתי רוויות (C14) ונגזרותיהם (ca. חומצה myristoleic, חומצה palmitoleic, כהלים התואם את גליצרול אסטרים) גם טופס שלפוחית בעקבות השיטה התייבשות סרט דק כל עוד ריכוז סה כ שומנים בדם הוא מעל cmc את ה-pH מאגר הידרציה קרובה pKa של חומצת השומן בתוך הקרום. מלבד טריס-HCl מאגר בשימוש פרוטוקול זה, מערכות אחרות-מאגר (ca. bicine, פוספט, בוראט) דווחו לתמוך היווצרות שלפוחית חומצת שומן, למרות שלפוחית נוצר מאגר פוספט או בוראט הם בדרך כלל די דולפים13. השלפוחיות המוגלתיות חומצת שומן שנוצר לאחר התייבשות הם polydisperse ו multilamellar, אבל בקלות מומרים קטנות monodisperse unilamellar שלפוחית על ידי ההבלטה כמתואר. לעומת sonication כאמצעי חלופי עבור יצירת שלפוחית קטנה, שחול מספק אפשרויות נוספות עבור הפקד של שלפוחית גודל על-ידי החלת ממברנות גודל הנקבוביות שונים. על ידי הגדלת מספר מחזורים שחול, ניתן להשיג שלפוחית עם התפלגות גודל לצר יותר, גודל ממוצע של קרוב גודל הנקבוביות קרום שלפוחית לאחר שחול בדרך כלל מעט יותר גדול מאשר גודל הנקבוביות ממברנה.
כדי לסנתז protocells תפקודית, חומצת שומן שלפוחית צריך מארח תגובות ביוכימיים ספציפיים הנובע ומגעים RNA או אבני הבניין השני. השיטה התייבשות סרט דק מספק דרך קלה כדי שלפוחית טופס המכיל חומרים שעברו אנקפסולציה הרצוי. עם זאת, היעילות כימוס נמוכה יחסית, חלק גדול של חומרים יקרים כגון RNA יאבדו בדרך כלל במהלך תהליך טיהור. במקרים מסוימים היעילות כימוס ניתן לשפר בצניעות לפי מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-להפשיר לפני ההבלטה. Microfluidic שיטות להכנת תשואה גבוהה פוספוליפיד ליפוזומים מאפשר כמעט 100% כימוס יעילות, אולם מקבילה לא ובכל זאת פותחו שיטות עבור שלפוחית חומצת שומן.
כאשר טיפול protocells עם chelated או חינם מ ג2 +, טיהור אחרי תוספת פתרון מגנזיום ו repurification לפני כל נקודת זמן מבטיחה סילוק דלף אנקפסולציה חומר אשר עלול להשפיע על הדיוק של קצב התגובה מדידות בתוך שלפוחית. מאז כל אחד לטיהור לוקח לפחות 10 דקות כדי להשיג הפרדה טובה וכדי לאסוף את השברים שלפוחית, הניתוח של התגובות מהיר הוא קשה, חייבים לעצור את התגובה לפני עמודה repurification.
פרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא גם מתאים לבנייה של חומצת שומן ליפוזומים לארח תגובות מחקה אלה שעלולים להתרחש בתאים פרימיטיבי. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים גם יישומים פוטנציאליים בפיתוח של מערכות משלוח ביו ריאקטורים לתגובות ביוכימיים אחרים.

ליפוזומים, או שלפוחית – תאים ותחום על-ידי ממברנות bilayer מורכבת amphiphilic שומנים - מצאו שימוש ביישומים ביו רבים כמו רכבי ההעברה עבור תרופות, מודלים של קרום התא, ועבור התפתחות סינתטיים תאים. אנחנו ואחרים גם המועסקים ליפוזומים כמודלים של קרום התא פרימיטיבי בחיים מוקדם. 1 , 2 , 3 , 4 . בדרך כלל, במערכות כאלה, אנו מעסיקים יחיד-שרשרת חומרים פעילי שטח המכיל הזנב פחמימן השומנים אחד בלבד (למשל, חומצה אולאית), כמו אלה מולקולות פשוטות יותר לסנתז ללא הסיוע של אנזימים מקודד חלבון תאי מודרני להעסיק.
ליפוזומים המורכבת של שומנים חד-שרשרת דומים לאלה של diacylphospholipids (למשל, 1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine, או POPC) כי הגבול הוא מורכב bilayer ממברנות. ליפוזומים נוצר גם מחלקה של ליפידים יכול לשמור תוכן מנה של מומס, יכול להיות לקצץ, מטוהרת על-ידי טכניקות שונות. מספר הבדלים חשובים כתוצאה כימי המאפיינים הייחודיים של שומנים חד-שרשרת. שלפוחית הנוצרת על-ידי פוספוליפידים יציבים על טווח pH רחבה, ואילו חומצת שומן שלפוחית יציבים רק ב- pH נייטרלי לבסיסי בלשון המעטה (ca. 7-9), המחייב מסוימים מאגר pH להכנה שלפוחית. רוב הזמן, מאגר זה עשויים להכיל מולקולות ספציפיות מסיסים שלפוחית כימוס, אשר יכול להיות גם חומרים פונקציונליים (למשל, ה-RNA) ממודר תגובות ביוכימיות או צבעי פלורסנט פשוטה (למשל, calcein ) עבור שלפוחית אפיון.
הנוכחות של רק שרשרת פחמימן יחיד מייצרת קרום זה הן יותר חדיר כדי מומסים בגבול, כמו גם דינמיות יותר. בנוסף, חומצה קרבוקסילית ראש הקבוצה נוכח תוצאות חומצות שומן שלפוחית כי הם יותר רגישים לנוכחות של קטיונים כלט ומלח (למשל, Mg2 +). מגנזיום הוא אחד קטיונים כלט החשוב ביותר עבור ותזרז בתגובות ביוכימיות protocells ללימודי מקור החיים. בחיים מוקדם, לפני האבולוציה של אנזימים חלבונים מתוחכמים, RNA ייתכן היה הפולימר דומיננטי, בשל יכולתה כפול לשכפל את עצמי ולבצע זרז. נציג דוגמה RNA הדורשים מגנזיום הקשורים התגובה היא RNA אנזימטי העתקה, שהראו שנות ה-60. 5 כאשר נוקלאוטידים הרנ"א כימית מופעל (כלומר 2-methylimidazolide נוקלאוטידים) לאגד מתחם פריימר-תבנית שישנו, קבוצת 3'-הידרוקסיל תחל התקפות של 5'-פוספט של מונומר מופעל סמוכים לעקור עזיבת קבוצה (קרי 2-methylimidazole) וטפסים חדש פוספודיאסטרי. כימיה העתקה זו RNA דורש ריכוז גבוה של Mg2 +, אשר צריך להיות chelated כדי להיות תואם עם חומצת שומן protocells. 6 מ ג עוד2 +-התגובה תלויה זה מזורז על ידי ריבוזים האמרהאד, וזה אולי הרנ א קטליטי מאופיין ביותר. ריבוזים הזה, אשר יכול להיות מחדש של שתי oligonucleotides קצר, מבצע תגובה עצמית-המחשוף נוח לפקח על-ידי שינוי ג'ל. ככזה, זה הוא לעתים קרובות מועסק בתור ריבוזים מודל במחקרים מקור החיים. 7 עקב דרישה מאת הזה ריבוזים עבור unliganded מגנזיום, ליפוזומים בדרך כלל נבנות על ידי תערובת של חומצות שומן אסטרים גליצרול חומצת שומן, אשר הם יציבים יותר כדי מגנזיום. 8 , 9 . פרוטוקול זה, אנו מציגים טכניקות פיתחו הכנה, מניפולציה, אפיון של שלפוחית הללו ואנו להדגים יישום של שלפוחית האלה כמו protocells על המארח-אנזימטי RNA העתקה של דג-פטיש ריבוזים זרז.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>sephorose 4B</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>4B200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>C0875-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-HCl pH8.0 1M</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td>
			<td>AM9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>71690-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oleic acid</td>
			<td>Nu-Chek</td>
			<td>U-46-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol monooleate</td>
			<td>Nu-Chek</td>
			<td>M-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss Rhodamine-PE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td>
			<td>L1392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride</td>
			<td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequagel concentrate</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequagel DILUENT</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-UREA GEL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC68852BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titon-100x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA template</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hammerhead substrate strand</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hammerhead ribozyme strand</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vesicle extruder set</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fraction collector</td>
			<td>Gilson, Inc.</td>
			<td>171041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9995941/675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax i3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon A1R MP Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Typhoon 9410 scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, purification, and use of fatty acid-containing liposomes

ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה המכילים diacylphospholipids בשל התכונות הכימיות ייחודי של אלה חומרים פעילי שטח. בפרט, חומצת שומן ליפוזומים לשפר את אופי דינמי, בשל המסיסות גבוה יחסית של חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת. באופן דומה, ליפוזומים המכיל חומצות שומן בחינם רגישים יותר קטיונים כלט ומלח, בשל האינטראקציות חזק בין קבוצות ראש חומצה קרבוקסילית יונים מתכתיים. כאן אנו ממחישים שיטות הכנה, טיהור של השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של חומרים פעילי שטח רשת יחיד (למשל, חומצות אולאית).

אנחנו בדרך כלל לבצע ליפוזום purifications על גודל-אי-הכללה של עמודות. ההכנות ליפוזום טיפוסי מכיל של fluorophore מסוג כלשהו. כאשר ליפוזומים שנוצרה, extruded, המין כימוס נמצאים בתוך ומחוץ ליפוזומים. וטיהור ליפוזומים על גודל-הדרה שרף (Sepharose 4B), מומסים בגבול unencapsulated נשמרים בתוך הנקבוביות של השרף, בזמן ליפוזומים גדולים אינם, elute הראשון (איור 1 א'). איסוף שברים של התוויית פלורסצנטיות לעומת שבר מספר (איור 1B) בדרך כלל מניבה עקבות 2-שיא, עם שברים מוקדם eluting המקביל ליפוזומים, אשר לאחר מכן נאספים וכוח ביישומים הבאים.
אנו בוחנים לעתים קרובות nonenzymatic תחל סיומת תגובות, אשר היו אמצעי סביר שכפול RNA לפני ייסודה של ריבוזים ו polymerases RNA חלבון מבוססת. תגובות אלו בדרך כלל מעסיקים פריימר fluorescently שכותרתו (איור 2 א), אשר נמתח מונומרים מופעל. תגובות אלו ניתן יהיה פיקוח על ידי אלקטרופורזה בג'ל (איור 2B), electropherograms שנוצר משולב כדי לקבל קצב קבועים עבור תנאי התגובה הנתונה (איור 2C).
כדי להדגים כי RNA יכול לתפקד בתוך protocells, אנו מעסיקים האמרהאד ריבוזים העצמי-המחשוף (איור 3 א) כתגובה דגם RNA קטליטי. התגובה הזו דורשת חינם מ ג2 + כדי לסייע זרז, לכן השתמשנו OA/GMO שלפוחית מאז הם יציבים בנוכחות 5 מ מ ג2 +. בדומה פריימר סיומת תגובות, התגובה העצמי-המחשוף של ריבוזים האמרהאד ניתן גם פיקוח על ידי אלקטרופורזה בג'ל (איור 3B) וניתח מאוחר יותר כדי לרכוש את קצב קבוע תחת תנאים מסוימים (איור 3C).
אנחנו תמונה ליפוזומים העסקת שני פלורסצנטיות, מועבר האור. ליפוזומים ניתן לסמן באמצעות שומנים פלורסנט, אשר לתת תווית ממברנה (איור 4A), או באמצעות של ממס פלורסנט בתוך שלהם לומן (איור 4B). אור המשודרת יכול לשמש גם כדי לצפות שלפוחית (גם שמוצג באיור 4B).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">טבלה 1.1 חומצה אולאית טהורה ב כלורופורם</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">רכיב</td>
			<td>מניות</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חומצה אולאית</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>11.7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">כלורופורם</td>
			<td></td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">שולחן 1.2 חומצה אולאית, גליצרול monooleate (9:1) ב כלורופורם</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">רכיב</td>
			<td>מניות</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חומצה אולאית</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>10.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">גליצרול monooleate</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>1.4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">כלורופורם</td>
			<td></td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חומצה אולאית 1.3 טבלה עם 0.2mol% Rhodamine-PE ב כלורופורם</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">רכיב</td>
			<td>מניות</td>
			<td>כמות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חומצה אולאית</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>1.6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rhodamine-PE של כלורופורם</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">כלורופורם</td>
			<td></td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. חומצת שומן כלורופורם פתרונות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg"> איור 1. שלפוחית אפיון פלורסצנטיות וטיהור של טיהור שבר. א הפרדה בין שלפוחית המכילה calcein מ- calcein חינם על עמודה 4B Sepharose. B. שלפוחית וזיהוי calcein חינם שיא ידי קרינה פלואורסצנטית היטב כל אחד לעומת מספר טוב אחרי שבר אוסף. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg"> באיור 2. שכפול RNA Non-אנזימטי בתוך שלפוחית OA. א ערכה של הארכת תחל RNA-אנזימטי. תמונת דף ב' לתגובה הרחבה תחל בתוך שלפוחית חומצה אולאית טהורה, עם תנאים כמו סעיף 4. ג לינארית מתאים של הלוגריתם הטבעי של היחס בין כמות פריימר שנותרו בהתחשב נקודת זמן לכמות פריימר לעומת זמן מעל 30 ה קצב התגובה הראשונית, שמחושבים השיפוע של ln (P/P0) לעומת הזמן, 0.058 h-1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg"> איור 3. האמרהאד המחשוף ריבוזים ב- OA/GMO שלפוחית. א ערכה של דג-פטיש ריבוזים המחשוף של המצע שכותרתו fluorescently סטרנד (למעלה). ב' דף תמונה של ראש פטיש המחשוף ריבוזים בתוך שלפוחית OA/GMO עם 5 מ מ ג2 +. ג. פעילות ריבוזים בתוך שלפוחית. התאמה לינארית של הלוגריתם הטבעי של היחס בין כמות המצע שנותרו בהתחשב נקודת זמן על כמות המצע לעומת בתקופה הראשונה 4 h התגובה הראשונית קצב, שמחושבים השיפוע של ln (S/S0) לעומת הזמן, הוא 0.36 ה-1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg"> באיור 4. חומצת שומן ענק שלפוחית על מיקרוסקופ. א קונפוקלית דימוי PE Rhodamine הנקרא חומצה אולאית שלפוחית, סולם בר 10 μm. B. מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונה של חומצה אולאית שלפוחית המכילה Alexa488 תוויות RNA עם ממברנה שמוצג בערוץ משודרים גלאי (TD), סולם בר 5 μm.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes at JoVE.com

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה diacylphospholipids המכיל בשל התכונות הכימיות ייחודי של חומרים פעילי שטח שרשרת אחת. כאן נתאר טכניקות עבור הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של אלה חומרים פעילי שטח.

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

מכשירי חימום המבוסס על לייזר מותאם אישית המיועדים לשחרור עורר, ציספלטין מThermosensitive יפוזומים עם הדרכת תמונת תהודה מגנטית

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

שימוש מיקרו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת עם חומצה Phosphotungstic הכנה לדמיין את רקמת האדם האנושי

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

הפקת מיקרופלואידים של Lysolipid המכילים טמפרטורה רגישה ליפוזומים

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...