Name: preparation, purification, and use of fatty acid-containing liposomes
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00
Duration: 10 min 43 s
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J.W.S. हावर्ड ह्यूजेस आयुर्विज्ञान संस्थान के जांचकर्ता हैं । यह काम एक अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था (२९०३६३) शमौन फाउंडेशन से J.W.S. के लिए दोनों A.E.E. और K.P.A. मिनेसोटा प्रारंभमें कोष के विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

<ol>
	<li>Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Models+of+Primitive+Cellular+Compartments:+Encapsulation,+Growth,+and+Division.">Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division.</a> Science. 302, 618-622 (2003).</li><li>Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tob&#233;, S., Da Treco, ., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+synthesis+of+a+genetic+polymer+in+a+model+protocell.">Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell.</a> Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).</li><li>Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+vesicles+of+monocarboxylic+acids+and+alcohols:+conditions+for+stability+and+for+the+encapsulation+of+biopolymers.">Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).</li><li>Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autopoietic+Self-Reproduction+of+Fatty+Acid+Vesicles.">Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).</li><li>Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Synthesis+of+Oligoadenylates+on+a+Polyuridylic+Acid+Template.">Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+template-directed+RNA+synthesis+inside+model+protocells.">Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+catalytic+oligoribonucleotide.">A small catalytic oligoribonucleotide.</a> Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).</li><li>Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+catalysis+in+model+protocell+vesicles.">RNA catalysis in model protocell vesicles.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).</li><li>Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+between+primitive+cell+membranes+and+soluble+catalysts.">Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts.</a> Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).</li><li>Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Template-directed+Synthesis+on+Random+Copolymers.">RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers.</a> J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).</li><li>Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+liposome+dialyzer+for+the+preparation+of+high-value,+small-volume+liposome+formulations.">Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations.</a> Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+large+monodisperse+vesicles.">Preparation of large monodisperse vesicles.</a> PloS one. 4 (4), e5009 (2009).</li><li>Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+extrusion+through+polycarbonate+track-etched+membranes+using+a+hand-held+mini-extruder.">Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder.</a> Methods Enzym. 533, (2013).</li></ol>

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

फैटी एसिड से गठित Liposomes उनके उच्च पारगम्यता और गतिशील गुणों के कारण आदिम कोशिकाओं के लिए संभावित मॉडल के रूप में कई द्वारा सुझाव दिया गया है. एकल चेन फैटी एसिड की carboxylic सिर समूह केवल एक सीमित पीएच रेंज में झिल्ली में आत्म विधानसभा की अनुमति देता है, और जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली लवण की उपस्थिति के लिए काफी संवेदनशील हैं । नतीजतन, फैटी एसिड बुलबुले फॉस्फोलिपिड बुलबुले के साथ तुलना में अलग तैयारी और हैंडलिंग तरीकों की आवश्यकता होती है ।
इस प्रोटोकॉल में, यद्यपि हम liposome गठन के लिए एक उदाहरण के रूप में ओलिक एसिड का उपयोग, अंय लंबी श्रृंखला unसंतृप्त फैटी एसिड (सी14) और उनके डेरिवेटिव (सीए. myristoleic एसिड, palmitoleic एसिड, और इसी शराब और ग्लिसरॉल एस्टर) भी बुलबुले के रूप में पतली फिल्म निर्जलीकरण के रूप में लंबे समय के रूप में कुल लिपिड एकाग्रता सीएमसी के ऊपर है और जलयोजन बफर पीएच झिल्ली के भीतर फैटी एसिड की pKa के करीब है के बाद । tris-HCl बफर के अलावा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, अंय बफर सिस्टम (ca. bicine, फॉस्फेट, बोराटे) फैटी एसिड पुटिका गठन का समर्थन करने के लिए सूचित किया गया था, हालांकि फॉस्फेट या बोराटे बफर में गठित बुलबुले आमतौर पर काफी टपका हुआ13हैं । निर्जलीकरण के बाद परिणामस्वरूप फैटी एसिड बुलबुले polydisperse और multilamellar हैं, लेकिन आसानी से बाहर निकालना द्वारा वर्णित के रूप में छोटे monodisperse unilamellar बुलबुले में परिवर्तित कर रहे हैं । छोटे बुलबुले पैदा करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में sonication के साथ तुलना में, बाहर निकालना अलग ताकना आकार झिल्ली लागू करने से पुटिका आकार के नियंत्रण के लिए और अधिक विकल्प प्रदान करता है । बाहर निकालना के बाद बुलबुले आम तौर पर झिल्ली ताकना आकार से थोड़ा बड़ा कर रहे हैं, लेकिन बाहर निकालना चक्र की संख्या में वृद्धि से, एक संकरा आकार वितरण के साथ बुलबुले और एक औसत आकार झिल्ली ताकना आकार के करीब प्राप्त किया जा सकता है ।
कार्यात्मक protocells को संश्लेषित करने के लिए, फैटी एसिड बुलबुले के लिए विशिष्ट जैव-रासायनिक आरएनए या अन्य इमारत ब्लॉकों के encapsulation के परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाओं की मेजबानी की जरूरत है । पतली फिल्म निर्जलीकरण विधि एक आसान तरीका है वांछित encapsulated सामग्री युक्त बुलबुले के रूप प्रदान करता है । हालांकि, encapsulation दक्षता अपेक्षाकृत कम है और शाही सेना के रूप में कीमती सामग्री का एक बड़ा अंश आम तौर पर शुद्धि प्रक्रिया के दौरान खो रहे हैं । कुछ मामलों में encapsulation दक्षता बाहर निकालना से पहले दोहराया फ्रीज-गल चक्र द्वारा मामूली सुधार किया जा सकता है । उच्च फॉस्फोलिपिड liposomes की उपज की तैयारी के लिए Microfluidic तरीके लगभग १००% encapsulation दक्षता के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन अनुरूप तरीके अभी तक फैटी एसिड बुलबुले के लिए विकसित नहीं किया गया है ।
जब या तो chelated या नि: शुल्क मिलीग्राम2 +के साथ protocells हैंडलिंग +, मैग्नीशियम समाधान इसके अलावा और प्रत्येक समय बिंदु से पहले शोधन के बाद शुद्धिकरण की लीक encapsulated सामग्री है कि प्रतिक्रिया की दर की सटीकता को प्रभावित कर सकता है को हटाने सुनिश्चित करता है बुलबुले के अंदर माप । के बाद से प्रत्येक शुद्धि के लिए अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए और पुटिका भागों को इकट्ठा करने के लिए ंयूनतम 10 मिनट लगते हैं, तेजी से प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण मुश्किल है, और प्रतिक्रिया स्तंभ शोधन से पहले बंद कर दिया जाना चाहिए ।
प्रोटोकॉल हम यहां मौजूद फैटी एसिड liposomes के निर्माण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि मेजबान उन है कि आदिम कोशिकाओं में हो सकता नकल उतारना प्रतिक्रियाओं । हमारे प्रोटोकॉल भी जैव चिकित्सा वितरण प्रणालियों और अंय जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया के विकास में संभावित अनुप्रयोगों को सक्षम करें ।

Liposomes, या बुलबुले-bilayer amphiphilic लिपिड के शामिल झिल्ली से घिरा डिब्बों फार्मास्यूटिकल्स, सेल झिल्ली के मॉडल के लिए प्रसव के वाहनों के रूप में कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग मिला है, और सिंथेटिक के विकास के लिए कोशिकाओं. हम और दूसरों को भी प्रारंभिक जीवन में आदिम कोशिका झिल्ली के मॉडल के रूप में liposomes कार्यरत है । 1 , 2 , 3 , 4 आमतौर पर, ऐसी प्रणालियों में, हम केवल एक लिपिड हाइड्रोकार्बन पूंछ (जैसे, ओलिक एसिड) युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles को रोजगार, के रूप में इन अणुओं कोडित प्रोटीन एंजाइमों आधुनिक कोशिकाओं के लाभ के बिना संश्लेषित करने के लिए सरल कर रहे है रोजगार ।
Liposomes एकल श्रृंखला लिपिड के शामिल diacylphospholipids से गठित उन लोगों के लिए समान हैं (जैसे, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, या POPC) कि सीमा bilayer झिल्ली से बना है. Liposomes लिपिड के या तो वर्ग से गठित एक भंग पेलोड बनाए रखने कर सकते हैं, और आकार छोटा और विभिंन तकनीकों से शुद्ध किया जा सकता है । कई महत्वपूर्ण मतभेद एकल श्रृंखला लिपिड के अद्वितीय रासायनिक विशेषताओं से परिणाम । फॉस्फोलिपिड द्वारा गठित बुलबुले एक व्यापक पीएच रेंज पर स्थिर हैं, जबकि फैटी एसिड बुलबुले तटस्थ में हल्के बुनियादी पीएच (ca. 7-9) के लिए ही स्थिर हैं, जो पुटिका तैयारी के लिए कुछ पीएच बफर की आवश्यकता है । समय के अधिकांश, इस बफर भी पुटिका encapsulation के लिए विशिष्ट घुलनशील अणुओं को शामिल कर सकते हैं, जो या तो कार्यात्मक सामग्री (जैसे, आरएनए) compartmentalized जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं या सरल फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे, calcein के लिए हो सकता है ) पुटिका लक्षण वर्णन के लिए ।
केवल एक एकल हाइड्रोकार्बन श्रृंखला की उपस्थिति एक झिल्ली है कि दोनों solutes को और अधिक पारगंय है, साथ ही अधिक गतिशील पैदा करता है । इसके अतिरिक्त, carboxylic एसिड सिर के बुलबुले में फैटी एसिड परिणाम में मौजूद समूह है कि और अधिक नमक और divalent cations की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील है (जैसे,2 मिलीग्राम +) । मैग्नीशियम की उत्पत्ति के लिए protocells में catalyzing जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए सबसे महत्वपूर्ण divalent cations में से एक है जीवन अध्ययन । प्रारंभिक जीवन में, परिष्कृत प्रोटीन एंजाइमों के विकास से पहले, आरएनए प्रमुख बहुलक हो सकता है, अपनी दोहरी क्षमता के कारण स्वयं को दोहराने और प्रदर्शन catalysis. एक मैग्नीशियम की आवश्यकता होती है आरएनए संबंधित प्रतिक्रिया के एक प्रतिनिधि उदाहरण गैर एंजाइमी आरएनए नकल है, पहले 1960 के दशक में प्रदर्शन किया । 5 जब रासायनिक आरएनए न्यूक्लियोटाइड (यानी 2-methylimidazolide न्यूक्लियोटाइड) एक मौजूदा प्राइमर टेम्पलेट जटिल करने के लिए बाइंड, 3 '-हाइड्रॉक्सिल समूह प्राइमर हमलों के 5 '-फॉस्फेट एक आसंन सक्रिय मोनोमर के विस्थापन के लिए छोड़ने के समूह (यानी 2-methylimidazole), और एक नया phosphodiester बांड रूपों । इस आरएनए नकल रसायन मिलीग्राम की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता है2 +, जो chelated करने की जरूरत है ताकि फैटी एसिड protocells के साथ संगत हो । 6 एक और मिलीग्राम2 +-निर्भर प्रतिक्रिया है कि हथौड़ा ribozyme, जो शायद सबसे अच्छी विशेषता उत्प्रेरक आरएनए है द्वारा catalyzed है । इस ribozyme, जो दो लघु oligonucleotides से पुनर्गठन किया जा सकता है, एक आत्म-दरार प्रतिक्रिया है कि एक जेल बदलाव से निगरानी करने के लिए सुविधाजनक है करता है । जैसे, यह अक्सर मूल जीवन के अध्ययन में एक मॉडल ribozyme के रूप में कार्यरत है । 7 unliganded मैग्नीशियम के लिए इस ribozyme द्वारा एक आवश्यकता के कारण, liposomes आम तौर पर फैटी एसिड और फैटी एसिड ग्लिसरॉल एस्टर, जो मैग्नीशियम के लिए और अधिक स्थिर है का एक मिश्रण द्वारा निर्माण कर रहे हैं । 8 , 9 इस प्रोटोकॉल में, हम तैयारी, हेरफेर, इन बुलबुले के लक्षण वर्णन और गैर एंजाइमी आरएनए नकल और हथौड़ा ribozyme की मेजबानी करने के लिए protocells के रूप में इन बुलबुले के आवेदन प्रदर्शित करने के लिए विकसित किया है हम वर्तमान तकनीक catalysis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>sephorose 4B</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>4B200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>C0875-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris-HCl pH8.0 1M</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td>
			<td>AM9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>251275-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>71690-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oleic acid</td>
			<td>Nu-Chek</td>
			<td>U-46-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol monooleate</td>
			<td>Nu-Chek</td>
			<td>M-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss Rhodamine-PE</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td>
			<td>L1392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride</td>
			<td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequagel concentrate</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequagel DILUENT</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% TBE-UREA GEL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EC68852BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titon-100x</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>T9284-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA template</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hammerhead substrate strand</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hammerhead ribozyme strand</td>
			<td>IDT</td>
			<td>5&#39;GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vesicle extruder set</td>
			<td>AVANTI POLAR LIPIDS</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fraction collector</td>
			<td>Gilson, Inc.</td>
			<td>171041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9995941/675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax i3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon A1R MP Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Typhoon 9410 scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, purification, and use of fatty acid-containing liposomes

Liposomes युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles, विशेष रूप से फैटी एसिड, इन amphiphiles के अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण diacylphospholipids युक्त उन लोगों की तुलना में अलग गुण दर्शाते हैं । विशेष रूप से, फैटी एसिड liposomes गतिशील चरित्र में वृद्धि, एकल श्रृंखला amphiphiles के अपेक्षाकृत उच्च घुलनशीलता के कारण । इसी प्रकार, liposomes युक्त मुक्त फैटी एसिड अधिक नमक और divalent cations के प्रति संवेदनशील हैं, carboxylic एसिड सिर समूहों और धातु आयनों के बीच मजबूत बातचीत के कारण । यहां हम तैयारी, शुद्धि के लिए तकनीक का वर्णन, और भाग या एकल श्रृंखला amphiphiles के पूरे में शामिल liposomes का उपयोग करें (उदा., ओलिक एसिड) ।

हम सामान्यतया आकार-बहिष्करण स्तंभों पर liposome शुद्धिकरण करते हैं. ठेठ liposome तैयारी किसी तरह का एक fluorophore होते हैं । जब liposomes उत्पन्न कर रहे हैं और बाहर निकाला, encapsulated किया जा करने के लिए प्रजातियों liposomes के अंदर और बाहर दोनों मौजूद हैं. एक आकार-अपवर्जन राल (Sepharose 4B) पर liposomes शुद्ध करके, unencapsulated solutes राल के pores के भीतर बनाए रखा, जबकि बड़ा liposomes नहीं कर रहे है और elute पहले (आंकड़ा 1a) । भागों का संग्रह और प्रतिदीप्ति बनाम अंश संख्या (चित्र 1b) आम तौर पर पैदावार एक दो चोटी का पता लगाने, जल्दी-eluting liposomes है, जो तब एकत्र कर रहे है और बाद में अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया भागों के साथ ।
हम अक्सर ribozyme और प्रोटीन आधारित आरएनए polymerases के उद्भव से पहले आरएनए प्रतिकृति का एक संभावित साधन थे जो nonenzymatic प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं, की जाँच. इन प्रतिक्रियाओं को आम तौर पर एक फ्लोरोसेंट लेबल प्राइमर (चित्र 2a), जो सक्रिय मोनोमर द्वारा विस्तारित है रोजगार । इन प्रतिक्रियाओं जेल ट्रो (चित्रा 2 बी) और परिणामस्वरूप electropherograms एक दी प्रतिक्रिया हालत (चित्रा 2c) के लिए दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए एकीकृत द्वारा निगरानी की जा सकती है ।
आरएनए protocells अंदर समारोह सकता है कि प्रदर्शन करने के लिए, हम एक मॉडल आरएनए उत्प्रेरक प्रतिक्रिया के रूप में ribozyme आत्म दरार (चित्रा 3) हथौड़ा रोजगार. यह प्रतिक्रिया मुक्त मिलीग्राम की आवश्यकता है2 + catalysis की सुविधा के लिए, और इसलिए हम OA प्रयोग/GMO बुलबुले के बाद से वे 5 मिमी मिलीग्राम2 +की उपस्थिति में स्थिर हैं । प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं के समान, हथौड़ा ribozyme स्व-क्लीवेज प्रतिक्रिया भी जेल ट्रो (चित्र3) द्वारा निगरानी की जा सकती है और बाद में विशिष्ट शर्तों के तहत दर लगातार प्राप्त करने के लिए विश्लेषण
हम छवि liposomes दोनों प्रतिदीप्ति और संचारित प्रकाश रोजगार । Liposomes फ्लोरोसेंट लिपिड का उपयोग कर लेबल किया जा सकता है, जो एक झिल्ली लेबल (चित्रा 4a), या उनके लुमेन के भीतर एक फ्लोरोसेंट घुला हुआ का उपयोग (चित्रा 4B) दे । संचारित प्रकाश भी बुलबुले का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( चित्रा 4Bमें दिखाया गया है) ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">तालिका १.१ क्लोरोफॉर्म में शुद्ध ओलिक अम्ल</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">घटक</td>
			<td>शेयर</td>
			<td>राशि</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ओलिक अम्ल</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>११.७ µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">क्लोरोफॉर्म</td>
			<td></td>
			<td>1 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">तालिका १.२ ओलिक अम्ल और ग्लिसरॉल monooleate (9:1) में क्लोरोफॉर्म</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">घटक</td>
			<td>शेयर</td>
			<td>राशि</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ओलिक अम्ल</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>१०.५ µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ग्लिसरॉल monooleate</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>१.४ µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">क्लोरोफॉर्म</td>
			<td></td>
			<td>1 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">टेबल १.३ ओलिक एसिड विथ 0.2 मॉल% Rhodamine-PE in क्लोरोफॉर्म</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">घटक</td>
			<td>शेयर</td>
			<td>राशि</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ओलिक अम्ल</td>
			<td>> 99%</td>
			<td>१.६ µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rhodamine-पे मे क्लोरोफॉर्म</td>
			<td>10 एमएम</td>
			<td>20 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">क्लोरोफॉर्म</td>
			<td></td>
			<td>1 मिलीलीटर</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1. फैटी एसिड क्लोरोफॉर्म समाधान ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg"> चित्र 1. शुद्धि अंश के पुटिका शुद्धिकरण और प्रतिदीप्ति लक्षण वर्णन. एक Sepharose 4B कॉलम पर मुक्त calcein से calcein युक्त बुलबुले के ए जुदाई । B. पुटिका और भिंन संग्रह के बाद एक अच्छी तरह से बनाम अच्छी संख्या में प्रतिदीप्ति की साजिश रचने के द्वारा मुक्त calcein चोटी का पता लगाने । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg"> चित्र 2. OA बुलबुले के अंदर गैर एंजाइमी आरएनए प्रतिकृति । गैर एंजाइमी आरएनए प्राइमर एक्सटेंशन की ए. योजना. शुद्ध ओलिक एसिड बुलबुले के अंदर एक प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया के बी पृष्ठ छवि, धारा 4 के रूप में शर्तों के साथ । C. प्राइमर की राशि के अनुपात के प्राकृतिक लघुगणक के रेखीय फिट दिया समय बिंदु पर किताब के प्रारंभिक राशि के लिए शेष बनाम । समय 30 से अधिक h. reaction की दर, ln की ढलान से गणना (p/p0) बनाम समय, ०.०५८ एच-1है । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg"> चित्र 3. हथौड़ा ribozyme दरार में OA/GMO बुलबुले । फ्लोरोसेंट लेबल सब्सट्रेट कतरा (ऊपर) के हथौड़ा ribozyme दरार की ए योजना. बी पृष्ठ छवि हथौड़ा ribozyme दरार के अंदर OA/5 मिमी मिलीग्राम2 +के साथ GMO बुलबुले । C. Ribozyme गतिविधि अंदर बुलबुले । समय पर शेष सब्सट्रेट की राशि के अनुपात के प्राकृतिक लघुगणक फिट सब्सट्रेट की प्रारंभिक राशि के लिए समय बिंदु पर पहले 4 ज. reaction दर में, ln की ढलान से गणना की (s/s0बनाम समय, ०.३६ एच-1है । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg"> चित्र 4. माइक्रोस्कोपी के लिए विशाल फैटी एसिड बुलबुले । ए Rhodamine पीई की एक फोकल माइक्रोस्कोपी छवि लेबल ओलिक एसिड पुटिका, स्केल बार 10 माइक्रोन । ख. ओलिक एसिड पुटिका की फोकल माइक्रोस्कोपी छवि युक्त Alexa488 लेबल आरएनए में दिखाया झिल्ली के साथ संचारित डिटेक्टर (टीडी) चैनल, स्केल बार 5 माइक्रोन.

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Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles, विशेष रूप से फैटी एसिड, एक श्रृंखला amphiphiles के अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण diacylphospholipids युक्त उन लोगों की तुलना में विशिष्ट गुणों का प्रदर्शन । यहां हम तैयारी, शुद्धि, और भाग या इन amphiphiles के पूरे में शामिल liposomes के उपयोग के लिए तकनीक का वर्णन ।

तैयारी, शुद्धि, और फैटी एसिड युक्त Liposomes का उपयोग

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

अस्थि पुनर्जनन के लिए मानव Perivascular स्टेम सेल का उपयोग

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

आयनों का पृथक्करण और न्यूक्लिक एसिड के शोधन के लिए पर चिप Isotachophoresis

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

तंत्रिका ऊतक उत्थान के लिए घुलनशील और अघुलनशील Biotinylated प्रोटीन की अभिव्यक्ति, अलगाव, और शोधन

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

चुंबकीय अनुनाद छवि मार्गदर्शन के साथ थर्मल Liposomes से Cisplatin की उत्प्रेरित रिलीज के लिए कस्टम डिजाइन लेजर आधारित ताप उपकरण

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

पर पल्स लेजर उत्तेजना सोने nanoparticle एकीकृत फोटो उत्तरदायी Liposomes और उनके microbubble Cavitation के मापन के संश्लेषण

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

सीएनएस को चिकित्सीय siRNA की डिलिवरी cationic और Anionic Liposomes का प्रयोग

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

मानव फाइब्रोमस्क्युलर ऊतक कल्पना करने के लिए फॉस्फोटंगस्टिक एसिड तैयारी के साथ माइक्रो एक्स-रे कम्प्यूटेड टॉमोग्राफी का उपयोग

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

व्यक्तिगत लिपोसोम्स के बीच रचनात्मक इनमोमोसिटी का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित एकल लिपोसम परख

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

सेल फ्री बैक्टीरियल अर्क, लिपोसोम्स और इमल्शन ट्रांसफर का उपयोग करके प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

लाइसोलिपिड युक्त तापमान-संवेदनशील लिपोसोम्स का माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...