Name: a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention de projet pilote du CREH Centre parrainé par NIEHS et par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 31572626).

Toutes les expériences animales ont été exécutés dans le respect de toutes les directives pertinentes, des règlements et des organismes de réglementation. Le protocole fait la démonstration a été réalisé sous la direction et l’approbation des institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) de la Texas A & M Institut pour la médecine génomique.
1. préparation de la solution
<ol><li>Diluer la solution saline équilibrée de Hank de x 10 à 1 x avec double distillée H...

<ol>
	<li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes:+increased+incidence+or+improved+survival?.">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?.</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li><li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus.">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).</li><li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants.">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li><li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+toxicity+in+&#946;-cells:+type+2+diabetes,+good+radicals+gone+bad,+and+the+glutathione+connection.">Glucose toxicity in &#946;-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li><li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells:+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction.">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li><li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells.">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways.">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li><li>Efendi&#263;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreastatin+and+islet+hormone+release.">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li><li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ah+receptor+and+NF-&#954;B+interactions,+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity.">Ah receptor and NF-&#954;B interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li><li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR/Cyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-[&#945;]-pyrene-induced+DNA+damage.">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[&#945;]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li><li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCB126+induces+differential+changes+in+androgen,+cortisol,+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells.">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li><li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes.">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).</li><li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta.">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li><li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57/BL6J+mice.">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li><li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phencyclidine+analogs+and+precursors:+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse.">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li></ol>

Accumulant les preuves suggère que l’exposition aux produits chimiques environnementaux joue un rôle important dans le développement de T2DM. Induite par le xénobiotiques ROS a été reconnue comme un facteur étiologique potentiel, contribuant au développement de T2DM. Les humains sont exposés à un large éventail de produits chimiques xénobiotiques et il y a un grand besoin de techniques de recherche novateurs pour identifier efficacement les substances toxiques du pancréas et d’étudier le mécanisme de t...

Augmentation de la prévalence de T2DM est devenus une crise de santé mondiale ces dernières années, posant une menace sérieuse pour la santé publique1. Plusieurs facteurs ont été trouvés à être causalement liée au développement de T2DM, parmi lesquels, récurrents résultats suggèrent que l’un points convergents communs pour ces facteurs sont l’induction de stress oxydatif, ce qui conduit à la génération d’excessive ROS2 , 3.
Un large éventail de produits chimiques environnementaux, y compris les BPC, les dioxines et BaP s’est avéré d’induire un stress oxydatif, qui peuvent nuire au fonctionnement des cellules β pancréatiques et conduire à l’insulino-résistance et T2DM4. Bien que le niveau physiologique de ROS joue un rôle important dans les fonctions cellulaires, exposition aux offices récepteurs qui dépasse la capacité du système antioxydant se traduit par des dommages aux cellules/tissus et conduit à des maladies5. Les cellules β du pancréas expriment un faible taux d’enzyme antioxydante et sont donc une cible sensible pour l’induite par le stress oxydatif6,7. Une exposition chronique à des concentrations élevées de ROS a été démontrée que la cause de dysfonctionnement des cellules pancréatiques induite par le stress5 ainsi que de la résistance à l’insuline dans le foie et le tissu adipeux8.
L’objectif global de ce projet est de développer un test d’amplification cellulaire aux produits chimiques pour leurs potentiels diabétogène basés sur leur induction de ROS dans les cellules du pancréas. Le pancréas n’a pas de détoxification métabolique et est une cible sensible pour les dommages causés par les xénobiotiques6,7. Par conséquent, de mesurer directement la ROS générées dans les cellules du pancréas, ce test devrait fournir une approximation directe de la lésion induite par le produit chimique dans le pancréas. Pour développer cette méthode, nous isolé des îlots pancréatiques de souris cultivées l’îlot isolé sous condition de culture cellulaire avec des produits chimiques et utilise la génération de ROS induite par le produit chimique comme la lecture. Cette procédure est simple et efficace pour identifier les ROS-induisant des produits chimiques dans l’îlot isolé ; Il peut être développé pour l’étude des mécanismes de toxicité qui sont spécifiques à la pancréas in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">10&#215;Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td style="width:283px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type 4</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polysucrose/sodium diatrizoate solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#8217;,7&#8217;-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescence microplate reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat/Mouse Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>EZRMI-13K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>Sorval RT7</td>
			<td>for 96-well plate centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td>for fluorescence reading</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals

L’exposition à certains produits chimiques environnementaux chez l’homme et les animaux s’est avérée de causer des dommages cellulaires des cellules β pancréatiques qui conduira au développement du diabète de type 2 (T2DM). Bien que les mécanismes pour les dommages de cellules β induite par le produit chimique étaient peu claires et susceptibles d’être complexe, une constatation récurrente est que ces produits chimiques provoquent un stress oxydatif conduisant à la génération de trop reactive oxygen species (ROS) qui provoquent des dommages aux la cellule β. Pour identifier les produits chimiques environnementaux de potentiel diabétogène, les auteurs ont isolé des cellules des îlots pancréatiques de souris C57BL/6 et des cellules des îlots cultivés dans des plaques de 96 puits cellulaires de la culture ; Ensuite, les cellules des îlots pancréatiques ont été dosés avec des produits chimiques et la production de ROS a été détectée par 2', 7'-dichlorofluorescéine (DHFC-DA) colorant fluorescent. En utilisant cette méthode, nous a constaté que le bisphénol A (BPA), Benzo [a] pyrène (BaP) et les polychlorobiphényles (PCB), risque d’entraîner des niveaux élevés de ROS, suggérant qu’ils peuvent induire potentiellement des dommages dans les cellules des îlots pancréatiques. Cette méthode devrait être utile pour le dépistage des xénobiotiques diabétogène. En outre, les cellules des îlots pancréatiques cultivées peuvent également être adaptés pour in vitro d’analyse de la toxicité induite par le produit chimique dans les cellules du pancréas.

Un balayage de l’îlot isolé sain est montré dans la Figure 2, dans lequel les îlots ont une forme ronde ou ovale avec grandeur relativement uniforme (bien que l’uniformité de la taille peut varier d’une souche à). Nous avons ensuite étudié les fonctions d’îlots pancréatiques lors d’un test in vitro en isolant l’îlot et en stimulant la sécrétion de l’insuline dans les îlots de culture. La figure 3</stro...

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A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules des îlots pancréatiques souris pour contrôler les inductions de ROS par les xénobiotiques afin d’identifier les potentiels chimiques xénobiotiques diabétogène.

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

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