Name: a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Pilotprojekt Stipendium CREH Zentrum gesponsert durch NIEHS und National Natural Science Foundation of China (Nr. 31572626) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden hingerichtet, unter Beachtung aller relevanten Richtlinien, Verordnungen und Aufsichtsbehörden. Das Protokoll wird gezeigt wurde unter der Leitung und Genehmigung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der Texas A & M Institut für Genomic Medizin durchgeführt.
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>10 X Hank ausgeglichene Salzlösung, 1 X mit doppelt destilliertem H2O verdünnen und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie di...

<ol>
	<li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes:+increased+incidence+or+improved+survival?.">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?.</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li><li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus.">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).</li><li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants.">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li><li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+toxicity+in+&#946;-cells:+type+2+diabetes,+good+radicals+gone+bad,+and+the+glutathione+connection.">Glucose toxicity in &#946;-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li><li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells:+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction.">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li><li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells.">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways.">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li><li>Efendi&#263;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreastatin+and+islet+hormone+release.">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li><li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ah+receptor+and+NF-&#954;B+interactions,+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity.">Ah receptor and NF-&#954;B interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li><li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR/Cyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-[&#945;]-pyrene-induced+DNA+damage.">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[&#945;]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li><li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCB126+induces+differential+changes+in+androgen,+cortisol,+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells.">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li><li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes.">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).</li><li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta.">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li><li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57/BL6J+mice.">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li><li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phencyclidine+analogs+and+precursors:+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse.">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li></ol>

Sammeln Beweise deutet darauf hin, dass die Exposition zu Umweltchemikalien spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des T2DM. XENOBIOTIKA-induzierte ROS wurde als ein möglicher ätiologischer Faktor zur Entwicklung des T2DM anerkannt. Menschen ein breites Spektrum von XENOBIOTIKA Chemikalien ausgesetzt sind, und es gibt ein großer Bedarf an neuartigen Forschungstechniken, effektiv die Bauchspeicheldrüse Giftstoffe zu identifizieren und zu untersuchen, den Mechanismus der Toxizität für die Zellen der Bauchspei...

Anstieg der Prävalenz von T2DM geworden in den letzten Jahren stellt eine ernsthafte Bedrohung für öffentliche Gesundheit1einer weltweiten Gesundheitskrise. Viele Faktoren gefunden worden zur Entwicklung des T2DM, darunter kausal verknüpft werden wiederkehrende Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine konvergente Gemeinsamkeit dieser Faktoren ist die Induktion von oxidativem Stress führt zu der Generation von übermäßigen ROS2 , 3.
Ein breites Spektrum von Umweltchemikalien wie PCB, Dioxine und BaP hat sich herausgestellt, induzieren oxidativen Stress beeinträchtigen die Funktion der Bauchspeicheldrüse β-Zellen und zu Insulin-Resistenz und T2DM4führen kann. Obwohl der physiologische Ebene von ROS in zellulären Funktionen eine wichtige Rolle spielt, ROS, die die Kapazität des antioxidativen Systems übersteigt führt zu Schäden an Zellen/Gewebe und führt zu Krankheiten5. Pankreatische β-Zellen express ein niedriges Niveau der antioxidativen Enzym, und somit ist eine sensible Zielgruppe für den oxidativen Stress-vermittelten Schäden6,7. Chronische Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von ROS wurde gezeigt, dass Stress-induzierte Pankreas Zelle Dysfunktion5 verursachen sowie Insulinresistenz in der Leber und Fettgewebe8.
Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, eine zellbasierte Assays Bildschirm Chemikalien für ihre diabetogene Potenziale basierend auf ihre Induktion von ROS in Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln. Die Bauchspeicheldrüse fehlt metabolische Entgiftung und ist ein sensibler Ziel für Fremdstoff-induzierten Schäden6,7. Daher soll dieser Assay durch direkte Messung der ROS erzeugt in den Zellen der Bauchspeicheldrüsen, eine direkte Annäherung an die chemisch induzierte Schädigung der Bauchspeicheldrüse. Um diese Methode zu entwickeln, wir Maus Pankreas Inseln isoliert, kultiviert die isolierte Insel unter Zelle Kultur Bedingung mit Chemikalien und genutzt, die chemisch induzierte ROS-Generation als das Auslesen. Dieses Verfahren ist einfach und effektiv bei der Identifizierung von ROS-induzierende Chemikalien in der isolierten Insel; Es kann für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität weiterentwickelt werden, die speziell für die Bauchspeicheldrüse in Vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">10&#215;Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td style="width:283px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type 4</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polysucrose/sodium diatrizoate solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#8217;,7&#8217;-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescence microplate reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat/Mouse Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>EZRMI-13K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>Sorval RT7</td>
			<td>for 96-well plate centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td>for fluorescence reading</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals

Exposition gegenüber bestimmten Umweltchemikalien in Mensch und Tier wurde gefunden, um zelluläre Schäden der Bauchspeicheldrüse β-Zellen verursachen, die zu die Entwicklung von Diabetes Mellitus Typ 2 (T2DM) führt. Obwohl die Mechanismen für die chemisch induzierte β Zellschädigung unklar und wahrscheinlich zu komplex waren, ist eine immer wiederkehrende Erkenntnis, dass diese Chemikalien verursachen oxidativen Stress führt zu der Generation von übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) die Schäden zu verursachen die β-Zelle. Ermittlung potenzieller diabetogene Umweltchemikalien, isoliert wir pankreatische Inselzellen von C57BL/6 Mäusen und kultivierten Inselzellen in 96-Well Zellplatten Kultur; dann wurden die Inselzellen mit Chemikalien dosiert und die ROS-Generation wurde von 2', 7'-dichlorofluoresceins (RLKV-DA) Fluoreszenzfarbstoff erkannt. Mit dieser Methode wir gefunden, dass Bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyren (BaP) und polychlorierten Biphenylen (PCB), können hohe Konzentrationen von ROS, was darauf hindeutet, dass sie potenziell Schaden in Inselzellen induzieren können induzieren. Diese Methode sollte für das screening von diabetogene XENOBIOTIKA nützlich sein. Darüber hinaus können die kultivierten Inselzellen auch für in-vitro- Analyse der chemisch induzierten Toxizität in Zellen der Bauchspeicheldrüse angepasst werden.

Ein Schliffbild der gesunden isolierten Insel ist in Abbildung 2gezeigt, in dem kleinen Inseln eine Runde oder ovale Form mit relativ einheitliche Größe haben (obwohl Größe Einheitlichkeit von Stamm zu Stamm unterschiedlich sein kann). Wir als Nächstes untersucht pancreatic Islet-Funktionen in einer in-vitro- Assay durch das Inselchen zu isolieren und Stimulierung der Insulinsekretion in den Kultur-Inseln. Abbildung 3</stron...

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A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Ein neues Screening-Verfahren für die gelenkte Evolution von thermostabilen Bakteriolytische Enzyme

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens

Eine Methode, um die Wirksamkeit der Handwäsche für die Entfernung von auftauchenden infektiösen Pathogenen zu testen

Handwashing is widely recommended to prevent infectious disease transmission. However, little comparable evidence exists on the efficacy of handwashing ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...