Name: a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto pilota da CREH centro sponsorizzato dal NIEHS e dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 31572626).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con tutte le pertinenti linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il protocollo in questione è stato effettuato sotto la guida e l'approvazione del istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Texas A & M. Istituto per la medicina genomica.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Diluire la soluzione salina bilanciata di Hank di 10 x 1 x con doppio distillata H2O e conservare a 4 ° C.</li>
...

<ol>
	<li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes:+increased+incidence+or+improved+survival?.">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?.</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li><li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus.">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).</li><li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants.">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li><li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+toxicity+in+&#946;-cells:+type+2+diabetes,+good+radicals+gone+bad,+and+the+glutathione+connection.">Glucose toxicity in &#946;-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li><li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells:+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction.">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li><li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCB126+induces+differential+changes+in+androgen,+cortisol,+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells.">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li><li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes.">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phencyclidine+analogs+and+precursors:+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse.">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li></ol>

Raccogliendo la prova suggerisce che l'esposizione ai prodotti chimici ambientali svolge un ruolo importante nello sviluppo di T2DM. ROS indotta da xenobiotici è stato riconosciuto come un potenziale fattore eziologico che contribuiscono allo sviluppo di T2DM. Gli esseri umani sono esposti a una vasta gamma di prodotti chimici xenobiotici e c'è un grande bisogno di tecniche di ricerca romanzo di identificare in modo efficace le sostanze tossiche del pancreas e di studiare il meccanismo della tossicità specifica per le...

Aumento della prevalenza di T2DM è diventati una crisi sanitaria globale negli ultimi anni ponevano una seria minaccia alla salute pubblica1. Molti fattori sono stati trovati per essere causalmente collegato allo sviluppo di T2DM, tra i quali, ricorrenti risultati suggeriscono che un comune punto convergente per questi fattori è l'induzione di stress ossidativo che porta alla generazione di eccessivo ROS2 , 3.
Un ampio spettro di prodotti chimici ambientali compresi PCB, diossine e BaP è stato trovato per indurre stress ossidativo, che può alterare la funzione delle cellule β del pancreas e portare a insulino-resistenza e T2DM4. Anche se il livello fisiologico di ROS svolge un ruolo importante nelle funzioni cellulari, l'esposizione a ROS che supera la capacità del sistema antiossidante provoca il danno ai tessuti o cellule e conduce a malattie5. Le cellule β del pancreas esprimere un basso livello di enzima antiossidante e quindi sono un obiettivo sensibile per il danno ossidativo di sforzo-mediati6,7. L'esposizione cronica ad alti livelli di ROS è stato indicato per causare la disfunzione di cellula pancreatica indotta da stress5 così come la resistenza di insulina nel fegato e nel tessuto adiposo8.
L'obiettivo generale di questo progetto è quello di sviluppare un'analisi basata su celle a sostanze chimiche di schermo per loro potenziali diabetogeni basati su loro induzione del ROS in cellule pancreatiche. Il pancreas manca disintossicazione metabolica ed è un obiettivo sensibile per danni indotti da xenobiotici6,7. Pertanto, misurando direttamente i ROS generati nelle cellule del pancreas, questo test dovrebbe fornire un'approssimazione diretta della ferita indotta da prodotto nel pancreas. Per sviluppare questo metodo, abbiamo isolato isolotti pancreatici del topo, coltivate l'isolotto isolato sotto condizione di cultura delle cellule con sostanze chimiche e utilizzate la generazione di ROS indotta da sostanze chimiche come la lettura. Questa procedura è semplice ed efficace nell'identificazione di prodotti chimici che inducono ROS nell'isolato isolotto; può essere ulteriormente sviluppato per indagine dei meccanismi di tossicità che sono specifici per il pancreas in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">10&#215;Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td style="width:283px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type 4</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>CLS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polysucrose/sodium diatrizoate solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2&#8217;,7&#8217;-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescence microplate reader&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat/Mouse Insulin ELISA Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>EZRMI-13K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorval</td>
			<td>Sorval RT7</td>
			<td>for 96-well plate centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Epoch 2</td>
			<td>for fluorescence reading</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals

L'esposizione a determinati prodotti chimici ambientali negli umani e negli animali è stato trovato per causare danno cellulare delle cellule β del pancreas che porterà allo sviluppo di diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Anche se i meccanismi per il danno cellulare indotto da chimica β erano poco chiare e probabile che sia complessa, una scoperta ricorrente è che queste sostanze chimiche inducono lo sforzo ossidativo che porta alla generazione di specie di eccessiva reattive dell'ossigeno (ROS) che inducono danni alla la cella β. Per identificare potenziali diabetogeni prodotti chimici ambientali, abbiamo isolato le cellule di Langerhans dai topi C57BL/6 e cellule dell'isolotto coltivate in piastre per colture cellulari di 96 pozzetti; cellule dell'isolotto sono state dosate con prodotti chimici, quindi la generazione di ROS è stata rilevata da 2', 7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) tintura fluorescente. Utilizzando questo metodo, abbiamo trovato che il bisfenolo A (BPA), Benzo [a] pirene (BaP) e policlorobifenili (PCB), potrebbe indurre elevati livelli di ROS, suggerendo che potenzialmente possono indurre danni in cellule dell'isolotto. Questo metodo dovrebbe essere utile per lo screening di xenobiotici diabetogeni. Inoltre, cellule dell'isolotto coltivate possono anche essere adattate per l'analisi in vitro della tossicità chimica-indotta in cellule pancreatiche.

Un Micrografo dell'isolotto isolato sano è illustrato nella Figura 2, in cui isolotti hanno una forma rotonda o ovale con relativamente uniforme dimensioni (anche se uniformità di dimensione può variare da ceppo a ceppo). Successivamente abbiamo studiato le funzioni pancreatiche in un'analisi in vitro isolando l'isolotto e stimolando la secrezione di insulina negli isolotti di cultura. La figura 3 Mostra la nostra ana...

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A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

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