Name: visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00
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Il lavoro di ricerca riportato in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto il premio numero R35GM124913, Purdue University PI4D programma di incentivazione e PVM interno competitivo Programma di fondi di ricerca di base. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale degli agenti finanziamenti. Ringraziamo il costrutto Tol2, Michael Lin per il costrutto ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon per il promotore ubi costruire attraverso Addgene.

Zebrafish sono alloggiati in una struttura animale AAALAC-approvato, e tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo i protocolli approvati dalla Purdue Animal Care and uso Comitato (PACUC).
1. Tol2 trasposone Miniprep costrutto
Nota: Tol2, un trasposone che è stato scoperto nei pesci medaka, ampiamente è stato utilizzato nello zebrafish ricerca comunità8,9. È stato adottato per il Gateway del sito r...

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	<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bioelectricity:+how+endogenous+voltage+potentials+control+cell+behavior+and+instruct+pattern+regulation+in+vivo.">Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).</li><li>Storace, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+Better+Genetically+Encoded+Sensors+of+Membrane+Potential.">Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential.</a> Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).</li><li>Inagaki, S., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+genetically+encoded+voltage+indicators+for+neural+activity+recording.">Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).</li><li>St-Pierre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor.">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).</li><li>Lieschke, G. 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P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation.">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo.">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators.">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

Sebbene le attività di elettrico livello cellulare e tissutale durante lo sviluppo embrionale e malattia umana sono stati scoperti molto tempo fa, i cambiamenti dinamici elettrici in vivo e loro ruoli biologici ancora rimangono in gran parte sconosciuti. Una delle sfide principali è quello di visualizzare e quantificare i cambiamenti elettrici. Tecnologia di patch clamp è un'innovazione per tenere traccia delle singole cellule, ma la sua applicazione agli embrioni vertebrati è limitato perché sono composte ...

Bioelettricità si riferisce a segnali elettrici endogeno mediato da canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare1. Lo scambio ionico attraverso la membrana cellulare e le modifiche correnti e potenziali elettriche accoppiate, è essenziale per la segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili. Inoltre, bioelettricità e gradienti ionici hanno una varietà di altre importanti funzioni biologiche, tra cui la conservazione dell'energia, biosintesi e trasporto del metabolita. Bioelettrica di segnalazione è stato scoperto anche come regolatore della formazione embrionale modello, come assi di corpo, il ciclo cellulare e di differenziazione delle cellule1. Pertanto, è fondamentale per la comprensione di molte malattie congenite umane che derivano da mis-regolamento di questo tipo di segnalazione. Anche se toppa morsetto è stato ampiamente utilizzato per la registrazione di singole cellule, è ancora lungi dall'essere ideale per il monitoraggio simultaneo di più celle durante lo sviluppo embrionale in vivo. Inoltre, tensione sensibili piccole molecole non sono anche ideali per applicazioni in vivo a causa della loro specificità, sensibilità e tossicità.
La creazione di una varietà di geneticamente codificato fluorescente tensione indicatori (GEVIs) offre un nuovo meccanismo per superare questo problema e permette per una facile applicazione studiare lo sviluppo embrionale, anche se essi sono stati originariamente inteso per monitoraggio neurale cellule di2,3. Uno della GEVIs attualmente disponibile è il sensore accelerato di potenziali di azione 1 (ASAP1)4. Si compone di un ciclo extracellulare di un dominio di rilevamento di tensione di tensione sensibile fosfatasi e una proteina fluorescente verde circolarmente permutata. Pertanto, ASAP1 permette la visualizzazione dei cambiamenti potenziali elettrici cellulari (polarizzazione: verde brillante; depolarizzazione: verde scuro). ASAP1 ha 2 ms on-e off cinetica e può tenere traccia di sottosoglia potenziale cambiamento4. Così, questo strumento genetico permette un nuovo livello di efficacia nel monitoraggio in tempo reale bioelettrica in cellule vive. Ulteriore comprensione dei ruoli di bioelettricità nello sviluppo embrionale e molte malattie umane, quali il cancro, sarà gettato nuova luce sui meccanismi sottostanti, che è fondamentale per la prevenzione e trattamento della malattia.
Zebrafish hanno dimostrato un potente modello animale per studiare biologia inerente allo sviluppo e malattie umane, compreso cancro5,6. Essi condividono geni ortologhi di 70% con gli esseri umani, e hanno simile vertebrati biologia7. Zebrafish fornire cura relativamente facile, una dimensione di grande frizione delle uova, trattabile genetica, transgenesi facile e trasparente esterno sviluppo embrionale, che li rendono un sistema superiore per in vivo imaging5,6. Una grande fonte di linee di pesci mutanti già presenti e un genoma completamente sequenziato, zebrafish fornirà una gamma relativamente illimitata della scoperta scientifica.
Per studiare in vivo in tempo reale attività elettrica delle cellule, approfittiamo del sistema modello zebrafish e ASAP1. In questo articolo, descriviamo come incorporare il biosensore fluorescente tensione ASAP1 il genoma di zebrafish utilizzando Tol2 trasposone transgenesi e visualizzare attività elettrica cellulare durante lo sviluppo embrionale, il pesce movimento larvale e nel tumore dal vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14mL cell culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-725</td>
			<td>E.Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose electrophoresis tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Owl B2</td>
			<td>DNA eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose RA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N605-500G</td>
			<td>For making the injection gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb1-ASAP1-F primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb2-ASAP1-R primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field dissection scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 745</td>
			<td>Dechorionation, microinjection, mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRc</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48336-001</td>
			<td>For holding fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette 3.4 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Fish embryos and water transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endonuclease enzyme, Not I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189L</td>
			<td>For linearizing plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent compound scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.A2</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent stereo dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Discovery.V12</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light source</td>
			<td>Lumen dynamics</td>
			<td>X-cite seris 120</td>
			<td>Light source for fluorescence microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500342</td>
			<td>Dechorionation and needle breaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Gateway BP recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12538120</td>
			<td>Gateway LR recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td>DNA gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>For loading injection solution into capilary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (1600cPs)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43146</td>
			<td>Fish embryo mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pneumatic Picopump PV820</td>
			<td>Microinjection injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manipulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Microinjector mm33 rechts</td>
			<td>Microinjection operation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>For preparing capillary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J217-500ml</td>
			<td>For calibrating injection volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolor camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Prepare small amount of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>For holding fish or fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td>mRNA cleaning after in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>For measuring DNA and RNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Micrometer</td>
			<td>Am Scope</td>
			<td>MR100</td>
			<td>Microinjection volume calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>DNA amplification for gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Raw glass for making cappilary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exL1 primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exR primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C404006</td>
			<td>Used for transformation during gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing fish or fish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV trans-illuminator 302nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>M-20V</td>
			<td>DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2853</td>
			<td>For transformation process of gene cloning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors

Bioelettricità, elettrico di segnalazione endogena mediata dai canali ionici e pompe situate sulla membrana cellulare, svolge i ruoli importanti nella segnalazione dei processi delle cellule neuronali e muscolari eccitabili e molti altri processi biologici, come embrionali patterning inerente allo sviluppo. Tuttavia, c'è una necessità per il monitoraggio di attività elettrica in vivo nell'embriogenesi dei vertebrati. I progressi degli indicatori di tensione fluorescenti geneticamente codificato (GEVIs) hanno reso possibile fornire una soluzione per questa sfida. Qui, descriviamo come creare una tensione transgenici indicatore zebrafish utilizzando l'indicatore di tensione stabilito, ASAP1 (accelerato di sensore di potenziali di azione 1), come esempio. Il kit Tol2 e un promotore di zebrafish onnipresente, ubi, sono stati scelti in questo studio. Spieghiamo anche i processi di clonazione site-specific di Gateway, Tol2 basati su trasposone zebrafish transgenesi e il processo di imaging per tumori di embrioni e pesce pesce di fase iniziale utilizzando microscopi normali epifluorescente. Usando questa linea di pesce, abbiamo trovato che ci sono variazioni di tensione elettrica cellulare durante l'embriogenesi zebrafish e pesce larvale movimento. Inoltre, è stato osservato che in alcuni tumori del fodero del nervo periferico maligno zebrafish, il tumore le cellule erano generalmente polarizzate rispetto ai tessuti normali circostanti.

In un'iniezione di successo, più di embrioni di pesce 50% iniettato visualizzerà un certo grado di fluorescenza verde nelle cellule somatiche, e la maggior parte di loro sarà positiva dall'analisi di Tol2 trasposone accise (Figura 2). Dopo 2-4 generazioni di fuori-croce con pesce wildtype (fino a quando il pesce fluorescente raggiungere il 50%, il rapporto previsto mendeliano), i pesci transgenici sono stati utilizzati per l'esperimento di formazione immag...

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Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...