Name: visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00
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이 간행물에 보고 된 연구 작업에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM124913, 퍼듀 대학 PI4D 인센티브 프로그램, 그리고 PVM 내부 경쟁에서 국립 보건원의 지원 기초 연구 자금 프로그램입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 자금 에이전트의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 Tol2 구문, ASAP1 구문에 대 한 마이클 린 고이치 가와카미를 감사 하 고 레너드 Zon ubi 발기인에 대 한 Addgene를 통해 생성.

Zebrafish는 AAALAC 승인 동물 시설에 보관 되어있습니다 그리고 모든 실험 프로토콜 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회 (PACUC)에 의해 승인에 따라 실시 했다.
1. Tol2 Transposon 플라스 미드 구조 준비
참고: Tol2, 메 다카 물고기에서 발견 되었다 transposon zebrafish 연구 커뮤니티8,9사용 널리 있다. 그것은 되었습니다 성공적으로...

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P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation.">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).</li><li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo.">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li><li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators.">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

있지만 세포와 조직 수준의 전기 활동 배아 개발 및 인간 질병 동안 오래 전에 발견 되었다, vivo에서 동적 전기 변화 및 그들의 생물학 역할 여전히 남아 크게 알 수 없는. 주요 과제 중 하나는 시각화 하 고 계량 전기 변화입니다. 단일 셀을 추적 하기 위한 휴식 통해 패치 클램프 기술 이다 하지만 그들은 많은 세포의 구성 되어 있기 때문에 척추 동물 배아의 응용 제한 됩니다. 현재 화학 전?...

전기 이온 채널과1세포 막 있는 펌프에 의해 중재 생 전기 신호를 말합니다. 세포 막과 결합 된 전기 잠재력과 현재 변화, 이온 교환 프로세스 고르기 신경 및 근육 세포의 신호에 대 한 필수적입니다. 또한, 전기 및 이온 기온 변화도 다른 중요 한 생물 학적 기능 에너지 저장, 생 합성, 대사 산물 수송 등의 다양 한이 있다. 생체 전기 신호도 몸 축, 세포 주기, 세포 감 별 법1등 미 발달 패턴 형성의 레 귤 레이 터로 발견 되었다. 따라서, 그것은 이러한 유형의 신호의 미 규제에 기인 하 많은 인간의 선 천 성 질병을 이해 중요 합니다. 패치 클램프 널리 사용 되었습니다 단일 셀 기록, 배아 발달 비보중 여러 셀의 동시 모니터링에 이상적에서 멀리 아직도 이다. 또한, 전압 민감한 작은 분자는 또한 그들의 특이성, 감도, 및 독성 vivo에서 애플리케이션에 적합 하지.
창조의 다양 한 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs) 제공이이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 인코딩되고 그들은 원래 신경 모니터링 위한 했다 비록 배아 개발 공부를 쉽게 응용 프로그램에 대 한 허용 2,3세포. 현재 사용할 수 있는 GEVIs 중 하나는 가속 센서의 활동 전위 1 (ASAP1)4입니다. 그것은 전압 과민 한 인산 가수분해 효소와 원형으로 배치 된 녹색 형광 단백질의 전압 감지 도메인의 extracellular 루프의 구성 됩니다. 따라서, ASAP1 세포 전기 잠재적인 변화의 시각화 수 (분극: 밝은 녹색; 도발은: 진한 녹색). ASAP1 속도 론 온 오프 2 ms, 있으며 subthreshold 잠재적인 변경4를 추적할 수 있습니다. 따라서,이 유전 도구 라이브 셀에 실시간 생체 모니터링에 효능의 새로운 수준에 대 한 수 있습니다. 배아 발달에 많은 인간 질병, 암, 등 전기의 역할의 더 이해 것입니다 창 고 기본 메커니즘에 새로운 빛이는 질병 치료 및 예방에 매우 중요.
Zebrafish 강력한 동물 모델 개발 생물학과 암5,6을 포함 하 여 인간의 질병을 입증 되었습니다. 인간, 70 %orthologous 유전자를 공유 하는 그들은 그리고 그들은 유사한 척 추가 있는 생물학7. Zebrafish는 비교적 쉽게 치료, 계란, 온순한 유전학, 쉬운 transgenesis, 그리고 투명 한 외부 배아 발달, 그들에 게 비보에 이미징5,6우수한 시스템의 큰 클러치 크기를 제공 합니다. 이미 존재 하는 돌연변이 물고기 선의 큰 소스와 완전히 시퀀스 게놈, zebrafish는 과학적 발견의 상대적으로 무제한 범위를 제공 합니다.
Vivo에서 실시간 전기 세포의 활동을 조사, 우리 활용 zebrafish 모델 시스템 및 ASAP1. 이 문서에서 우리는 형광 전압 바이오 센서 ASAP1 Tol2 transposon transgenesis를 사용 하 여 zebrafish 게놈으로 통합 하는 방법을 설명 하 고 배아 개발, 물고기 애벌레 움직임, 그리고 라이브 종양에서 세포 전기 활동을 시각화 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14mL cell culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-725</td>
			<td>E.Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose electrophoresis tank</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Owl B2</td>
			<td>DNA eletrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose RA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N605-500G</td>
			<td>For making the injection gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb1-ASAP1-F primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attb2-ASAP1-R primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td>
			<td>ASAP1 coding region amplification for subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field dissection scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 745</td>
			<td>Dechorionation, microinjection, mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRc</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concave slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48336-001</td>
			<td>For holding fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette 3.4 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Fish embryos and water transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endonuclease enzyme, Not I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189L</td>
			<td>For linearizing plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent compound scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager.A2</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifuorescent stereo dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stereo Discovery.V12</td>
			<td>Fish embryo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light source</td>
			<td>Lumen dynamics</td>
			<td>X-cite seris 120</td>
			<td>Light source for fluorescence microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500342</td>
			<td>Dechorionation and needle breaking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Gateway BP recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12538120</td>
			<td>Gateway LR recombination cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td>DNA gel purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>For loading injection solution into capilary needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose (1600cPs)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43146</td>
			<td>Fish embryo mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pneumatic Picopump PV820</td>
			<td>Microinjection injector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manipulator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Microinjector mm33 rechts</td>
			<td>Microinjection operation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>For preparing capillary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J217-500ml</td>
			<td>For calibrating injection volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocolor camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td>Fish embryo image recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Prepare small amount of plasmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>For holding fish or fish embryos during imaging process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1015</td>
			<td>mRNA cleaning after in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>For measuring DNA and RNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Micrometer</td>
			<td>Am Scope</td>
			<td>MR100</td>
			<td>Microinjection volume calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>T100</td>
			<td>DNA amplification for gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Raw glass for making cappilary needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exL1 primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2-exR primer</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td>
			<td>Tol2 excise assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C404006</td>
			<td>Used for transformation during gene cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>For anesthetizing fish or fish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV trans-illuminator 302nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>M-20V</td>
			<td>DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2853</td>
			<td>For transformation process of gene cloning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of cellular electrical activity in zebrafish early embryos and tumors

전기, 내 생 전기적 신호 이온 채널에 의해 중재 및 세포 막에 있는 펌프 고르기 신경 및 근육 세포의 프로세스와 같은 다른 많은 생물 학적 과정, 신호에 중요 한 역할 배아 개발 패턴입니다. 그러나, vivo에서 전기 활동 모니터링 척추 embryogenesis에 대 한 필요가 있다. 인코딩된 유전자 형광 전압 표시기 (GEVIs)의 진보는이 전에 대 한 솔루션을 제공할 수 만들었습니다. 여기, 우리 유전자 변형 전압 표시기 zebrafish 설립된 전압 표시기, ASAP1를 사용 하 여 만드는 방법에 설명 (가속 센서의 활동 전위 1), 예를 들어. Tol2 키트와 유비 쿼터 스 zebrafish 발기인, ubi, 이 연구에서 선정 됐다. 우리는 또한 게이트웨이 사이트 복제, Tol2 transposon 기반 zebrafish transgenesis, 그리고 일반 epifluorescent 현미경을 사용 하 여 초기 단계 물고기 배아와 물고기 종양에 대 한 이미징 프로세스의 프로세스를 설명 합니다. 이 물고기 라인을 사용 하 여, 우리는 제 브라 embryogenesis, 그리고 물고기 애벌레 운동 하는 동안 세포 전기 전압 변화는 발견. 또한, 몇 가지 zebrafish 악성 말 초 신경 칼 집 종양, 셀은 일반적으로 편광 종양 주변 정상 조직에 비해 관찰 되었다.

성공적인 주입, 주입 50% 물고기 배아는 체세포에 녹색 형광의 어느 정도 표시 됩니다 그리고 그들의 대부분은 Tol2 transposon 소비 분석 결과 (그림 2)에 의해 긍정적인 것 보다 더 많은. 후 2-4 세대-wildtype 물고기 (까지 형광 물고기 도달 예상된 Mendelian 비율 50%)와 교차, 유전자 변형 물고기 배아 개발 하는 동안 세포 막 잠재력을 추적 하기 위해 이미징 실?...

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Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...