Name: titration elisa as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction
Uploaded: 2018-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction at JoVE.com

Protokollen og algoritmen ble utviklet i prosjektet finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 og EB177/13-1). Forfatteren Takk Barbara Schedding og Felix Schmalbein kundestøtte og Dr. Niland for kritisk lesing manuskriptet.

1. lager løsninger
<ol><li>For å forberede 100 mL 10 x TBS pH 7.4 løsning, oppløse 6.06 g TRIS og 8.77 g NaCl i 90 mL deionisert vann, justere pH 7,4 med 37% HCl løsning, fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.</li>
	<li>For å forberede 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 løsning, oppløse 23.83 g HEPES i 90 mL deionisert vann, justere pH 7,4 med 1,5 M NaOH, fylle volumet til 100 mL med deionisert vann og filtrere løsningen.</li>
	<li>For å forberede 100 mL 5 M NaCl løsning, løses 29,2...

<ol>
	<li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+law+of+mass+action+to+binding+by+proteins;+interactions+with+calcium.">The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium.</a> Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).</li><li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-receptor+complexes:+origin+and+development+of+the+concept.">Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept.</a> J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).</li><li>Bisswanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+1:+Multiple+Equilibria,+Principles+and+Derivations.">Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations.</a> Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , 1-26 (2017).</li><li>Shimura, K., Kasai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+gel+titration:+quantitative+analysis+of+the+binding+equilibrium+between+immobilized+protein+and+free+ligand+by+a+continuous+titration+procedure.">Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure.</a> Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).</li><li>Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-aptamer+binding+studies+using+microchip+affinity+capillary+electrophoresis.">Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis.</a> Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).</li><li>Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+binding+affinities+by+pulse+proteolysis:+application+to+TEM-1/BLIP+protein+complexes.">Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes.</a> Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).</li><li>Latour, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Langmuir+isotherm:+a+commonly+applied+but+misleading+approach+for+the+analysis+of+protein+adsorption+behavior.">The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior.</a> J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).</li><li>Stockell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+diphosphopyridine+nucleotide+by+yeast+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase.">The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).</li><li>Heyn, M. P., Weischet, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+fluorescence+studies+on+the+binding+of+ligands+to+the+&#945;+subunit+of+tryptophan+synthase.">Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the &#945; subunit of tryptophan synthase.</a> Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).</li><li>Campbell, I. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+structure,+activation,+and+interactions.">Integrin structure, activation, and interactions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).</li><li>Zeltz, C., Gullberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin-collagen+connection--a+glue+for+tissue+repair?.">The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair?.</a> J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).</li><li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).</li><li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+integrin+regulation+and+signaling.">Structural basis of integrin regulation and signaling.</a> Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).</li><li>Luo, B. H., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+structures+and+conformational+signaling.">Integrin structures and conformational signaling.</a> Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).</li><li>Ricard-Blum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collagen+family.">The collagen family.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).</li><li>Eble, J. A., Tuckwell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;2&#946;1+integrin+inhibitor+rhodocetin+binds+to+the+A-domain+of+the+integrin+&#945;2+subunit+proximal+to+the+collagen-binding+site.">The &#945;2&#946;1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin &#945;2 subunit proximal to the collagen-binding site.</a> Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).</li><li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;2&#946;1+integrin-specific+antagonist+rhodocetin+is+a+cruciform,+heterotetrameric+molecule.">The &#945;2&#946;1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule.</a> FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).</li><li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+and+concerted+conformational+changes+enable+rhodocetin+to+block+&#945;2&#946;1+integrin+selectively.">Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block &#945;2&#946;1 integrin selectively.</a> PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).</li><li>Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reveal+the+alteration+of+the+rhodocetin+structure+upon+&#945;2&#946;1+integrin+binding.">Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon &#945;2&#946;1 integrin binding.</a> Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).</li><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunizations.">Chapter 5: Immunizations.</a> Antibodies, a laboratory manual. 5, 53-138 (1988).</li><li>Lu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+interactions+between+SSB+and+proteins+by+the+use+of+fluorescence+anisotropy.">Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy.</a> Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).</li><li>Fielding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+determination+of+protein-ligand+dissociation+constants.">NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants.</a> Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).</li><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).</li><li>McDonnell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance:+towards+an+understanding+of+the+mechanisms+of+biological+molecular+recognition.">Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition.</a> Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).</li><li>Pesquero, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+and+kinetic+parameter+estimation+of+the+affinity+interaction+of+jArtinM+and+rArtinM+with+peroxidase+glycoprotein+by+the+electrogravimetric+technique.">Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).</li><li>Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+acquisition+and+analysis+of+microscale+thermophoresis+data.">On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data.</a> Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).</li></ol>

Titrering ELISA er en allsidig test å finne ut av en reseptor-ligand interaksjon. Som serine ELISA omgår nødvendigheten å skille gratis og bundet ligander effektivt og analysere konsentrasjonene kvantitativt, vesentlig mer studier og publikasjoner har ansatt titrering ELISAs i stedet for innspillingen bindende kurver . Videre titrering ELISAs er enkle å utføre og krever rimelig lave mengder reseptoren og ligand. For nøyaktig analyse av dissosiasjon konstanter, må ren forberedelser reseptor og ligand brukes. Skade...

Dissosiasjon konstant K er en viktig parameter å beskrive affinitet til en reseptor (R) for sin ligand (L). Basert på loven massevirkningsloven, er K definert for likevekt, der reseptor-ligand komplekse RL dissociates reseptoren R og ligand L:
<img alt="Equation 1 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq1.jpg">            Formel 1
med indekser f indikerer gratis/ubundet staten reseptor og ligand. Konsentrasjonen av reseptor-ligand komplekset, RL, er identisk med konsentrasjonen av reseptor-bundet ligand Lb. Den totale konsentrasjonen av reseptor Rt er summen av gratis reseptor Rf og ligand binding reseptor Rb = Lbdissosiasjon konstant kan også skrives som:
<img alt="Equation 2 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq2.jpg">        Ligning 2
Derfor metning gir Y, definert som brøkdel av bundet ligand Lb i forhold til den totale konsentrasjonen av reseptor Rt,
<img alt="Equation 3 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq3.jpg">        Formel 3
avhengig av konsentrasjonen av gratis ligand Lf:
<img alt="Equation 4 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq4.jpg">        Ligningen 4
Denne hyperbolsk relasjonen beskriver bindende kurven av en reseptor-ligand interaksjon og tomten sin viser konsentrasjonen av bundet ligand Lb som en funksjon av konsentrasjonen av gratis ligand Lf. Fra binding kurven, kan dissosiasjon konstant K avledes som konsentrasjonen av gratis ligand på halv maksimal metning gir. Videre er ulike algoritmer for å linearize binding kurver etablert, for eksempel dobbel-gjensidige tomten av Klotz1,2eller transformasjoner etter Scatchard eller Hanes (anmeldt av Bisswanger3). Men lider alle algoritmer problemet som maksimumsverdien for metning avkastningen, som er asymptotisk nærmet på høye konsentrasjoner av gratis ligand i bindingen kurven, fastsettes i en grafisk pre vurdering og derfor feilutsatte.
I tillegg krever fastsettelse av en bindende kurve kvantifisering av gratis og bundet ligand under binding likevekt. Dette må gratis ligand være atskilt fra reseptor-bundet ligand og kvantifisert. Det ligand og reseptor må derfor varierer i sine egenskaper, for eksempel en ikke-protein ligand i motsetning til en protein reseptor. Hvis begge bindende partnere proteiner, har de skal skilles i størrelsene, kostnader eller andre molekylære funksjoner. Likevel er kvantifisering av ligand konsentrasjoner i småskala bindende tilnærminger en vanskelig oppgave. Radioaktivt merking av ligand har ofte vært nødvendig å finne den lav konsentrasjonen av bundet ligand, spesielt hvis betydelige mengder reseptorer ikke var tilgjengelige og rimelige. Videre kan reseptor-bundet ligand distansere under og etter isolasjon i et ikke-ubetydelig måte. Derfor er komplekse metoder, for eksempel likevekt gel filtrering4, kapillære geleelektroforese5og puls proteolyse6, pålagt å kvantifisere reseptor-bundet ligand og skiller den fra gratis ligand.
I motsetning til disse bindende analyser krever ikke titrering eksperimenter kvantitative separasjon av bundet og gratis ligand. Dette er en reseptor i en konstant konsentrasjon titreres med ulike konsentrasjoner av ekstra ligand. Ved binding til reseptoren har bundet ligand en Biofysiske egenskap som skiller den fra gratis ligand og målbare f.eks, fotometri, fluorometry eller antistoff gjenkjenning. Dermed et signal S, som er proporsjonal med metning gir Y og følgelig også til konsentrasjonen av reseptor-bundet ligand (Lb), registreres som en funksjon av den totale konsentrasjonen av ekstra ligand (Lt). Både parametere, signalet S og den totale konsentrasjonen av ekstra ligand er kvantifisert på en direkte og enklere måte enn konsentrasjonen av bundet og gratis ligand. Spesielt, gjenkjenning av reseptor-bundet ligand av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) tillatt reduksjon av eksempel volumer til under 100 µL og parallelle målinger av flere ligand konsentrasjoner i flere godt microtiter plater. I en titrering ELISA, en reseptor fysisk adsorbert til en være ferdig innen plate på samme konsentrasjonen og titreres med løselig ligand. Reseptoren er immobilisert til plast overflaten i hovedsak av hydrofobe adsorpsjon. Overflaten konsentrasjonen av immobilisert reseptor korrelerer med belegg konsentrasjonen av reseptoren i en lineær relasjon, trolig etter Langmuir´s adsorpsjon isotherm7. I tillegg til det totale antallet adsorbert reseptor-molekyler er deres aktivitetstilstand en viktig parameter for titrering analyser. Bare immobilisert reseptorer som har beholdt ligand binding aktivitet, er relevante for titrering analysen og til slutt bidrar til den totale konsentrasjonen av aktive reseptorer Rt av titrering analysen, som ikke kan bestemmes direkte.
Nettsteder på plast overflaten, som ikke dekkes av immobilisert reseptoren er utsatt for adsorberes andre proteiner, som ligand. Fysisk adsorpsjon av ligand til slike plast overflaten nettsteder vil resultere i en lignende signal som reseptor-bundet ligand, men på en uspesifisert måte. Redusere uspesifikke signalet, plast overflaten nettstedene til de microtiter platene som ikke har vært belagt med protein, men vil bli blokkert med bovin serum albumin (BSA). Men for noen reseptor-ligand titrering analyser, kan uspesifikke bakgrunn signaler observeres. Så, andre blokkerer agenter, som en løsning av 0,2% eller 0,04% mellom 20, anbefales.
Etter binding til reseptoren, er gratis ligand fjernet av to vask trinn. Bundet ligand fortsatt med reseptoren, som er immobilisert til plast overflaten av være ferdig innen brønnen, og eventuelt forsterket av kjemiske fiksering. For påfølgende kovalente kryss-sammenhengen bundet ligand og immobilisert reseptor med glutaraldehyde erstattes buffer stoffet TRIS for HEPES, uten noen endring i ligand binding. HEPES, i motsetning til TRIS, deaktivere ikke glutaraldehyde. Kovalente kryss-sammenhengen med glutaraldehyde løser bundet ligand med sin reseptoren og hindrer sin avstandtagen under vask og inkubasjon fremgangsmåten. Dermed reseptor-ligand samspillet er kjemisk frosset og garanterer en titrering kurve som ikke påvirkes av etterfølgende trinnene vask og inkubasjon. Imidlertid kan glutaraldehyde fiksering kjemisk endre ligand og reseptor slik at deres samspill er redusert eller avskaffet. Videre endres modifikasjon av epitopes innen ligand forpliktende tilhørighet oppdage antistoff, spesielt hvis et monoklonalt antistoff brukes å kvantifisere bundet ligand. Selv om ingen av disse bivirkninger av glutaraldehyde fiksering oppstår i denne titrering ELISA, må følsomheten til testen mot glutaraldehyde testes for hver reseptor-ligand interaksjon før titrering eksperimentet. Etter fiksering fjernes overflødig glutaraldehyde i tre vask trinn med TRIS inneholder buffer. TRIS deaktiverer gjenværende aldehyd grupper som nonspecifically kan reagere med oppdage antistoffer i det påfølgende trinnet.
Mengden av bundet ligand er kvantifisert med koblede enzym-antistoffer, som gir en fotometriske ELISA signal S. Dette er plottet mot den totale ligand konsentrasjon Lt lagt i hver brønn. Til tross for oppkjøpet enklere er titrering kurve ikke en hyperbolsk funksjon i motsetning til bindende kurven. Videre har vært uklart hvordan beregne dissosiasjon konstant K fra en titrering kurve. Selv om algoritmer for å linearize tyske ervervet titrering kurver er uavhengig rapportert av Stockell8 og Heyn og Weischet9, de falt kort på grunn av deres usikkerhet beregne maksimalt signalet verdi som den metning avkastning tilnærminger på høye konsentrasjoner av ekstra ligand.
Her er en titrering ELISA og en ikke-lineær regresjon algoritmen beskrevet å utlede dissosiasjon konstanten K for en reseptor ligand interaksjon fra en titrering kurve. Denne protokollen er eksemplifisert for samspillet av kollagen-bindende A-domenet integrin α2β1 med en slange gift-avledet inhibitor. Integrins er celle vedheft molekyler, som megle ankerplass celleområdet til den omkringliggende ekstracellulær matrisen eller den underliggende kjelleren membran10,11. Videre formidle integrins viktig signaler mellom cellene og den ekstracellulære matrisen ved rekruttere ytterligere signalnettverk molekyler og danner nye cellen organeller, adhesomes, på cellen matrise samhandling12,13, 14. kollagen, ligand av α2β1 Integra er det mest rikelig proteinet i kroppen og er en avgjørende stillas komponent av bindevev15. Samspillet mellom α2β1 integrin og kollagen er formidlet av A-domenet integrin α2 delenhet. Integrin α2A-domenet inneholder en divalent kasjon, som kreves for kollagen bindende og stabiliseres dets struktur. Vill-type form samt mutanter α2A domenet, slik som den som overflaten-eksponerte rester Y216 hadde blitt erstattet for glysin, lett produsert recombinantly i en bakteriell uttrykk system og isolert via deres oligo-hans-koder med en NiNTA superflow kolonne med en påfølgende dialyse mot TRIS-bufret saltvann (SS, 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) inneholder 2 mM MgCl216. Konsentrasjonene var bestemt med bicinchoninic syre analysen (BCA) og deres purities er testet av konvensjonelle SDS side og farget med Coomassie-Brilliant blå R250.
Samspillet mellom α2β1 integrin og kollagen blokkeres ved binding av snake venom komponenten, rhodocetin, Malayan grav viper (Calloselasma rhodostoma)16,17. Brukes som en løselig ligand i denne titrering ELISA, rhodocetin var renset fra råoljen gift som beskrevet tidligere16. Det er oppløst i HEPES-bufret saltvann (HBS, 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) og lagres fryses på 20 ° C. Konsentrasjonen ble bestemt av BCA og sin renhet ble påvist av SDS-side. Som opptrer, rhodocetin ikke bare blokkerer kollagen binding til integrin α2β1 A-domenet, men også stabiliserer inaktive konformasjon av integrin og dermed hindre noen signalene fra kollagen i celler eller blodplater18. Det er stor biomedisinsk betydning dissosiasjon konstant av rhodocetin med reseptor målet og dermed rakne sin molekylære mekanisme og farmasøytiske potensielle f.ekssom en antithrombotic agent. For dette formål, en titrering ELISA beskrives inkludert evalueringen er som gjelder for nesten alle reseptor-ligand interaksjon med en 1:1 samhandling støkiometri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>neoFrox</td>
			<td>1125KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>1,316,591,214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>172571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant</td>
			<td></td>
			<td>isolated in author&#39;s lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiNTA superflow column&#160;</td>
			<td>Qiagen, Germany</td>
			<td>30821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-Brilliant Blue R250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumine (BSA), fraction V</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 % solution of glutaraldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn(II)-acetate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar half-area microtiter plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Corning 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate ELISA reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

titration elisa as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction

Dissosiasjon konstant beskriver samspillet mellom to partnere i bindingen likevekt og er et mål på deres slektskap. Det er en viktig parameter å sammenligne forskjellige ligander, f.eks, konkurrerende hemmere, protein isoformene og mutanter, for deres bindende styrke til en bindende partner. Dissosiasjon konstanter bestemmes ved å plotte konsentrasjoner av bundet versus gratis ligand som bindende kurver. Titrering kurver, som er et signal som er proporsjonal med konsentrasjonen av bundet ligand plottet mot den totale konsentrasjonen av ekstra ligand, er mye enklere å registrere. Signalet kan oppdages tyske og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Dette er eksemplifisert i en protokoll for en titrering ELISA som måler binding av snake venom-avledet rhodocetin til sin immobilisert måldomene av α2β1 integrin. Titrering ELISAs er allsidig og brukte. Noen par samspill proteiner kan brukes som immobilisert reseptoren og løselig ligand, forutsatt at begge proteiner er rene og konsentrasjonene er kjent. Vanskeligheten har så langt vært å finne dissosiasjon konstant fra en titrering kurve. I denne studien introdusert en matematisk funksjon underliggende titrering kurver. Uten noen feilutsatte grafisk estimering av en metning avkastning kan denne algoritmen behandling av rådata (signal intensiteter i ulike konsentrasjoner av ekstra ligand) direkte av matematiske evaluering via ikke-lineær regresjon. Dermed flere titrering kurver kan registrert samtidig og forvandlet til et sett med karakteristiske parametere, blant dem dissosiasjon konstant og konsentrasjonen av binding-aktiv reseptoren, og de kan evalueres statistisk. Kombinert med denne algoritmen, titrering ELISAs får fordelen av direkte presentere dissosiasjon konstant. Derfor kan de brukes mer effektivt i fremtiden.

Etter ELISA har blitt utviklet, den gule fargen av konverterte isoenzymer underlaget, para- nitrophenolate, indikerer at mengden av bundne rhodocetin ligand reduseres med minkende konsentrasjoner av ekstra rhodocetin fra kolonner 1 til 11 (figur 1). Fargeløs brønnene i rhodocetin-fri brønnene i 12-kolonnen viser en lav bakgrunn signal.
Fotometriske kvantifisering ved 405 nm gir data, som...

Watch this Scientific Journal Video about Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction at JoVE.com

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

En detaljert protokoll for å utføre en titrering ELISA er beskrevet. Dessuten vises en ny algoritme evaluere titrering ELISAs og hente en dissosiasjon konstant av binding av en løselig ligand til en være ferdig innen plate-immobilisert reseptor.

Titrering ELISA som metode for å bestemme dissosiasjon konstant reseptor Ligand interaksjon

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Utnytte Etylen-frigjørende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som et verktøy for å studere Etylen Response i Bakterier

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En planarisk motilitetsanalyse for å måle de biomodulerende egenskapene til naturlige produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...