Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Vi takker og anerkender Dr. Peter Nelson og Sonya Anderson på UK-ADC hjernen væv Bank for at levere alle menneskelige hjerne vævsprøver (NIH giver nummer: P30 AG028383 fra National Institute on Aging). Vi takke Matt Hazzard og Tom Dolan, informationsteknologi, akademiske teknologi og Fakultet Engagement, University of Kentucky for grafisk assistance. Dette projekt blev støttet af tilskud antal 1R01NS079507 fra det nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde (til BB) og ved tilskud antal 1R01AG039621 fra National Institute on Aging (til A.M.S.H.). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde eller National Institute on Aging. Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Nedenstående oplysninger er baseret på aktuelle sikkerhed og lovgivningsmæssige standarder på University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Vedrøre institutionens biologiske sikkerhed program og mest aktuelle regler og anbefalinger som en sikkerhedsforanstaltning, før du arbejder med humant væv.
Forsigtig: Humant væv kan være en kilde af blodbårne patogener, herunder human immundefekt virus (HIV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV) m.fl. Arbejde med menneskeligt væv udg?...

Denne protokol beskriver isolering af intakt og levedygtige menneskelige hjerne kapillærer fra frisk væv. I dette afsnit skal vi drøfte i detaljer følgende: 1) ændringer til protokollen, 2) fejlfinding af almindelige fejl, 3) begrænsninger af teknikken, 4) betydningen af den model med hensyn til eksisterende og alternative blod - hjerne barrieren modeller, og 5). potentielle ansøgninger om isolerede menneskelige hjerne kapillærer.
Protokollen beskrevet her er optimeret til 10 g frisk m...

Blod - hjerne barrieren er en stramt kontrolleret grænseflade mellem blod og hjerne, der bestemmer, hvad går ind og kommer ud af hjernen. Anatomisk, endotelceller komponere blod - hjerne barrieren og danner en kompleks, fortløbende kapillær netværk. Fysiologisk, leverer denne kapillære netværk hjernen med ilt og næringsstoffer, mens samtidig bortskaffelse af kuldioxid og metaboliske affald produkter. Vigtigere, understøtter beviser, at ændringerne af barrieren bidrage til mange sygdomme, herunder Alzheimers sygdom, epilepsi og slagtilfælde1,2,3,4,5 , 6 , 7. brain endotelceller også tjene som en barriere for behandling af blokerende stof udbredelse ind i hjernen, fx., kemoterapi af glioblastom multiforme efter tumor resektion8,9, 10. isolerede menneskelige hjerne kapillærer repræsenterer i denne sammenhæng en unik ex vivo blod - hjerne barrieren model, der ligner barriere egenskaber in vivo, som giver mulighed for undersøgelse af barriere funktion og dysfunktion i sundhed og sygdom. I denne artikel leverer vi en protokol for at isolere hjernen kapillærerne fra menneskelige hjerne på en konsekvent høj kapillær kvalitet og udbytte for at studere blod - hjerne barrieren.
I 1969, Siakotos mfl. 11 var de første til at rapportere isolering af hjernen kapillærerne fra kvæg og menneskelige hjernevæv ved hjælp af tæthed gradient centrifugering og glas perle kolonne adskillelse. Senere, Goldstein et al. 12 forbedret denne metode ved at tilføje flere filtrering trin for at reducere mængden af væv for at studere hjernen kapillærerne isoleret fra rotter, samtidig med at den metaboliske aktivitet af glukose transport. Siden da har optimeret forskere kapillær isolation procedure adskillige gange, og slog forbedre den metode og hjernen kapillær model med hver iteration13,14,15. For eksempel, Pardridge mfl. 16 isoleret bovin kapillærer ved hjælp af enzymatiske fordøjelsen snarere end mekanisk homogenisering, og derefter bestået efterfølgende en kapillær suspension gennem en 210 µm mesh-filter og et glas perle kolonne. Disse ændringer forbedret trypan blå udstødelse pletten af isolerede hjernen kapillærerne, og dermed øget endotel cellernes levedygtighed. I begyndelsen af 1990 ' erne, Dallaire mfl. 17 isoleret kvæg og rotte kapillærer, der var klart af neuronal forurening og vedligeholdt metaboliske aktivitet af γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase), og basisk fosfatase. I 2000, Miller mfl. 18, anvendes isoleret rotte og svin hjernen kapillærerne i kombination med Konfokal mikroskopi viser ophobning af transport substrater til lumen af kapillærer. Efterfølgende vores laboratorium har fortsat med at optimere hjernen kapillær isolation procedure og vi har etableret transport assays for at bestemme P-glykoprotein (P-gp)19,20,21, brystkræft modstand protein (BCRP)22,23, og multi lægemiddelresistens protein 2 (Mrp2)24 transportaktiviteter. I 2004 offentliggjorde vi to rapporter hvor vi brugt isolerede rotte hjernen kapillærerne til at undersøge forskellige signaling veje. I Hartz mfl. 21, vi fandt, at peptid endothelin-1 hurtigt og reversibelt reduceret P-gp transport funktion i hjernen kapillærerne ved at handle gennem endothelin receptor B (ETB) receptor, nitrogenoxid syntase (NOS) og protein kinase C (PKC). I Bauer et al. 19, vi viste udtryk for nukleare receptor pregnane X receptor (PXR) og viste PXR-graduering af P-gp udtryk og transport funktion i hjernen kapillærerne. I eksperimenter med transgene humaniseret PXR mus, vi udvidet denne linje af forskning og viste i vivo stramning af barrieren ved upregulating P-gp gennem hPXR aktivering25. I 2010, Hartz mfl. 26 bruges denne fremgangsmåde til at gendanne P-gp protein udtryk og transportere aktivitet i transgene menneskelige amyloid forløber protein (hAPP) mus, der overexpress hAPP. Desuden reduceret genoprette P-gp i hAPP mus betydeligt amyloid beta (Aβ)40og Aβ42hjerne niveauer.
Ud over at studere signaling veje, kan isolerede hjernen kapillærerne bruges til at bestemme forandringer i kapillær permeabilitet, som vi refererer til som kapillær lækage. Især bruges Texas rød lækage analysen til at vurdere lækage af fluorescerende farvestof Texas rød fra kapillær lumen over tid, og disse data bruges derefter til at analysere lækage priser. Øget kapillær lækage priser sammenlignet med dem fra kontrol kapillærer angiver ændringer i blod - hjerne barrieren2fysiske integritet. Dette er værdifuldt, fordi der er mange sygdomstilstande tilknyttet barriere forstyrrelser, fx., epilepsi, sklerose, Alzheimers sygdom og traumatisk hjerne skade27,28,29, 30. Andre grupper har også udnyttet isolerede kapillærer for at skelne signaling veje, der regulerer protein udtryk og transport aktivitet af proteiner31,32,33,34, 35,36,37. Endelig har vi fortsat at optimere denne metode til dyrkning af menneskelige hjerne kapillærer, og for nylig, viste vi øget P-gp udtryk på den menneskelige blod - hjerne barrieren hos patienter med epilepsi i forhold til beslaglæggelse-gratis kontrol personer38 . Taget sammen, viser disse udvikling, at isolerede hjernen kapillærerne kan tjene som en alsidig model at studere barriere funktion.
Forskellige in vivo, ex vivo, og in vitro- blod - hjerne barrieren modeller har været brugt i grundforskning og industrielt stof screening, hovedsageligt med mål at teste medicinafgivelse til hjernen39,40,41 ,42,43,44. Ud over isolerede ex vivo hjernen kapillærerne omfatter nuværende blod - hjerne barrieren modeller i siliciummangan modeller, in vitro- cellekultur af isolerede hjernen kapillære endotelceller eller udødeliggjort cellelinjer fra forskellige arter, i vitro kultur af humane pluripotente stamceller (hPSC) at differentiere i hjernen kapillære endotelceller, og mikrofluid modeller på en chip.
I siliciummangan modeller er mest almindeligt anvendt i udvikling af lægemidler til valg af drug kandidater baseret på forventede absorption, distribution, metabolisme og udskillelse (ADME) egenskaber. Metoder såsom kvantitative struktur-ejendom forholdet (QSPR) modeller og kvantitative struktur-aktivitet relationer (QSAR) modeller er populære metoder, der anvendes i high throughput screening af biblioteker til at forudsige hjernen penetration af lægemiddelkandidater 45 , 46. disse modeller er nyttige til raster molekylerne for barriere penetration egenskaber.
Betz et al. 47 etableret encellelag af kulturperler hjernen kapillære endotelceller som en in vitro- blod - hjerne barrieren modelsystem. In vitro celle kultur modeller bruger frisk væv eller udødeliggjort endotel cellelinjer såsom menneskelige cerebral microvessel endothelial celler (hCMECs) kan være en anden høj overførselshastighed screeningsværktøj til hjernen penetration eller Mekanistiske undersøgelser. Men hjernen kapillære endotelceller celle kultur modeller mangler den fysiologisk shear stress af blodgennemstrømningen inde kapillær lumen, er begrænset i samlede biologiske kompleksitet og undergå ændringer i udtryk og lokalisering af vigtig barriere komponenter såsom tight junction proteiner kanaler overflade receptorer, transportvirksomheder, enzymer og ion48,49,50. Omvendt, endotel encellelag stammer fra hPSCs, har lav saccharose permeabilitet i forhold til hCMEC/D3 kulturer og indeholder polariseret udtryk for nogle blod - hjerne barrieren transportvirksomheder, adhæsionsmolekyler, og stramme kryds51, 52. imidlertid disse celler er også omfattet af skiftende egenskaber i kulturen, og systemet skal være valideret til sin sammenfatning i vivo barriere egenskaber52.
Nyere tendenser i blod - hjerne barrieren forskning omfatter udnytter 3D vævskultur systemer for at skabe kunstige kapillærer, ved hjælp af orgel-on-chip-teknologi til at generere mikrofluid enheder, eller udnytte hule fibre teknologi53, 54 , 55. kunstige kapillærer, men har betydeligt større diameter (100 – 200 µm) end hjernen kapillærerne (3-7 µm). Dermed ligner shear styrker in vitro- ikke helt i vivo situation. Dette er taget op i "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrofluid enheder, hvor kunstige membraner form "blod" og "hjerne" rum og væsker er pumpet gennem disse enheder genererer mikrofluid shear styrker. Ligeledes er co kulturer i endothelial celler i forskellige kombinationer med astrocytter og vaskulære glatte muskelceller også blevet brugt med hule fibre teknologi til at genskabe rheologiske parametre findes under i vivo betingelser56 , 57 , 58. det er dog uklart, hvor godt denne model afspejler andre egenskaber af blod - hjerne barrieren som transport, metabolisme, signalering, m.fl. Disse kunstige kapillær og chip modeller er velegnede til høj overførselshastighed screening af narkotika, men de celler, der bruges til at generere disse modeller kan også ændres under kultur.
Frosne og faste hjernen skiver eller primære hjerne kapillære endotelceller cellekulturer er yderligere modeller, der kan bruges til atstudere den menneskelige microvasculature5,59,60,61. For eksempel, immunhistokemi fast hjernen væv bruges til at bestemme protein lokalisering og udtryk i sund sammenlignet med sygt væv.
Ud over væv skiver og in vitro- modeller kan beskrevet ovenfor, frisk isolerede hjernen kapillærerne udnyttes til at studere blod - hjerne barrieren funktion. Begrænsninger af denne isolerede kapillær model omfatter er vanskeligheden at få friske menneskelige hjernevæv, manglende astrocytter og neuroner, og en forholdsvis tidskrævende isoleret proces. En fordel ved den isolerede hjerne kapillær model er at denne model ligner i vivo situation, og derfor kan bruges til at karakterisere barriere funktion og dysfunktion. Vigtigere er, kan det også bruges til at skelne signaling mekanismer ved hjælp af et væld af assays og molekylære teknikker3,19,62,63.
Vores laboratorium har adgang til både ferske og frosne menneskelige hjernevæv gennem Sanders-Brown Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. I denne forbindelse Obduktioner følger en standard-protokol, hjerner er fremstillet i < 4 h, og alle procedurer i overensstemmelse med NIH Biospecimen bedste praksis retningslinjer65. Givet denne enestående adgang til menneskelige hjernevæv, vi etableret og optimeret en protokol for at isolere hjernen kapillærerne fra menneskelige hjernevæv, der resulterer i et højt udbytte af intakt og bæredygtige menneskelige hjerne kapillærer. To fælles slutpunkter af interesse er at bestemme protein udtryk og aktivitet. Vi og andre har i denne forbindelse etableret forskellige assays, der kan bruges med isolerede hjernen kapillærerne for at studere protein udtryk og aktivitetsniveau. Disse assays omfatter Western blotting, enkle Western assay, enzymmaerket assay (ELISA), reverse transkription polymerase kædereaktion (RT-PCR), kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR), zymography, transport aktivitet assays, og kapillær lækage assays. Disse assays giver forskere til at studere ændringer i barriere funktion i menneskelige patologiske betingelser, bestemme veje, der styrer protein udtryk og aktivitet og identificere farmakologiske mål for behandling af blod - hjerne barrieren forbundet sygdomme.
Taget sammen, frisk isolerede hjernen kapillærerne kan tjene som en robust og reproducerbare model af blod - hjerne barrieren. Især, kan denne model kombineres med mange forskellige assays til at bestemme en bred vifte af slutpunkter til at studere barriere funktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Forståelse blod - hjerne barrieren funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold er afgørende for udviklingen af nye terapeutiske strategier, at holde løftet om at forbedre hjerne medicinafgivelse, forbedre hjerne beskyttelse og behandle hjernen lidelser. Men at studere funktionen menneskelige blod - hjerne barrieren er udfordrende. Der er således et kritisk behov for passende modeller. Hjernen kapillærerne isoleret fra menneskelige hjernevæv repræsenterer i denne sammenhæng et unikt værktøj til at studere barriere funktion som tæt på menneskelig i vivo situation som muligt. Her, beskriver vi en optimeret protokol for at isolere kapillærer fra menneskelige hjernevæv på et højt udbytte og med ensartet kvalitet og renhed. Kapillærer er isoleret fra frisk menneskelige hjernevæv ved hjælp af mekaniske homogenisering, massefylde-gradient centrifugering og filtrering. Efter isolationen, kan de menneskelige hjerne kapillærer bruges til forskellige anvendelser, herunder lækage assays, levende celle imaging og immun-baserede assays til at studere protein udtryk og funktion, enzymaktivitet eller intracellulær signalering. Isolerede menneskelige hjerne kapillærer er en unik model at belyse regulering af funktionen menneskelige blod - hjerne barrieren. Denne model kan give indsigt i centralnervesystemet (CNS) patogenese, som vil bidrage til udviklingen af terapeutiske strategier for behandling af CNS lidelser.

Isolering fra menneskelige hjernevæv udbytte en suspension, beriget med menneskelige hjerne kapillærer (figur 1B) med små mængder af større fartøjer, røde blodlegemer, andre enkelt celler og nogle celle debris. Nogle kapillærer er forgrenet, og i nogle, rød blod celler er fanget i de kapillær lumen. Den typiske kapillær har en 3-7 µm diameter og er ca 100-200 µm lange med åben lumen; de fleste kapillær ender er skjult. Bruger Konfokal mikroskop...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering af cerebrale kapillærer fra frisk menneskelige hjernevæv

Isolerede hjernen kapillærerne fra menneskelige hjernevæv kan bruges som en prækliniske model til at studere barriere funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Vi præsenterer her, en optimeret protokol for at isolere hjernen kapillærerne fra frisk menneskelige hjernevæv.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder til Undersøgelse af Neuronal morfogenese:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryoniske murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk implantation for kronisk Optogenetic Stimulation af hjernevæv

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering af cerebrospinalvæske fra Gnaver Embryoner til brug med dissekeret Cerebral Cortikale Eksplantater

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering og dyrkning af endotelceller fra embryonale forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Isolering og Kanylering af cerebral Parenkymalt arterioler

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og Gene Expression Analyse af Fos-udtrykkende neuroner fra Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Udledning af leptomeninges eksplantatkulturer fra Postmortem menneskehjerne donorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

En rotte Model af Mild intrauterin Hypoperfusion med Microcoil stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...