Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Wij danken en erkennen van Dr. Peter Nelson en Sonya Anderson in de UK-ADC hersenen weefselbank voor het verstrekken van alle menselijke hersenen weefselmonsters (NIH grant nummer: P30 AG028383 van het National Institute on Aging). Wij danken Matt Hazzard en Tom Dolan, Information Technology Services, academische technologie en de betrokkenheid van de faculteit, Universiteit van Kentucky voor grafische bijstand. Dit project werd ondersteund door subsidie nummer 1R01NS079507 van het nationale Instituut van Neurological Disorders and Stroke (naar B.B.) en nummer 1R01AG039621 van de subsidie van het National Institute on Aging (te A.M.S.H.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Institute of Neurological Disorders en lijn of het nationale Instituut op veroudering. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De informatie hieronder is gebaseerd op de huidige veiligheids- en wettelijke normen aan de Universiteit van Kentucky, Lexington, KY, Verenigde Staten. Als voorzorgsmaatregel inzake veiligheid, verwijzen naar de biologische veiligheidsprogramma van de instelling en de meest recente verordeningen en aanbevelingen voor het werken met menselijk weefsel.
Let op: Menselijk weefsel kan ook een bron van bloed overgedragen ziekteverwekkers, met inbegrip van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), h...

Dit protocol beschrijft het isolement van intact en levensvatbare menselijk brein haarvaten van vers weefsel. In dit gedeelte bespreken we in detail de volgende: 1) wijzigingen in het protocol 2) oplossen van veel voorkomende fouten, 3) beperkingen van de techniek, 4) de betekenis van het model met betrekking tot bestaande en alternatieve bloed - hersenbarrière modellen, en 5). mogelijke toepassingen voor geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten.
Het protocol hier beschreven is geoptimalise...

De bloed - hersen-barrière is een strak gecontroleerde interface tussen het bloed en de hersenen die bepaalt wat er in en uit de hersenen komt. Anatomisch, endotheliale cellen componeren van de bloed - hersenbarrière en vormt een complexe, voortdurende capillaire netwerk. Fysiologisch, levert dit capillaire netwerk de hersenen met zuurstof en voedingsstoffen terwijl tegelijkertijd verwijdering van kooldioxide en afvalstoffen stofwisselingsproducten. Nog belangrijker is, ondersteunt bewijs dat de wijzigingen in de barrière aan vele ziekten bijdragen, waaronder de ziekte van Alzheimer, epilepsie en beroerte1,2,3,4,5 , 6 , 7. hersenen endotheliale cellen ook als een belemmering voor de behandeling dienen door het blokkeren van opname van de drug in de hersenen, bv., chemotherapie van glioblastoma multiforme na tumor resectie8,9, 10. In dit verband geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten vertegenwoordigen een unieke ex vivo bloed - hersenbarrière model dat sterk lijkt op barrière eigenschappen in vivo, die het mogelijk voor de studie van de barrièrefunctie en dysfunctie in gezondheid maakt en ziekte. In dit artikel geven wij een protocol om te isoleren van de haarvaten van de hersenen van menselijke hersenen op een constant hoog capillaire kwaliteit en opbrengst om te bestuderen van de bloed - hersenbarrière.
In 1969, Siakotos et al. 11 waren de eersten die het verslag van het isolement van de haarvaten van de hersenen van runderen en menselijk hersenweefsel met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren en glazen kraal kolom scheiding. Later, Goldstein et al. Deze methode verbeterd 12 door het toevoegen van meerdere filtratie stappen om te verminderen van de hoeveelheid weefsel te bestuderen van de haarvaten van de hersenen van ratten, geïsoleerd met behoud van de metabole activiteit van glucose vervoer nodig. Sindsdien onderzoekers geoptimaliseerd de capillaire isolatie procedure talloze malen, verbetering van de methode en de hersenen capillaire model met elke iteratie13,14,15. Bijvoorbeeld, Pardridge et al. 16 boviene haarvaten met behulp van enzymatische spijsvertering in plaats van mechanische homogenisering geïsoleerd, en dan vervolgens doorgegeven een capillaire schorsing door een 210 µm mesh filter en een glazen kraal kolom. Deze wijzigingen de trypan blauwe uitsluiting vlek van geïsoleerde hersenen haarvaten verbeterd en dus verhoogd endothelial cel levensvatbaarheid. In de vroege jaren 1990, Dallaire et al. 17 geïsoleerd runderen en rat haarvaten, die waren duidelijk van neuronale besmetting en onderhouden metabole activiteit of alkalische fosfatase en Gamma-glutamyl transferase (γ-GTase). In 2000, Miller et al. 18, gebruikt geïsoleerde rat en varkens hersenen haarvaten in combinatie met confocale microscopie te tonen van de accumulatie van vervoer substraten in het lumen van de haarvaten. Vervolgens ons laboratorium doorgegaan met het optimaliseren van de hersenen capillaire isolatie procedure en wij hebben vastgesteld dat vervoer testen om te bepalen van P-glycoproteïne (P-gp)19,20,21, borstkanker weerstand eiwit (BCRP)22,23, en meerdere drugweerstand eiwit 2 (Mrp2)24 vervoersactiviteit. In 2004 publiceerden we twee verslagen waar we gewend geïsoleerde rat hersenen haarvaten verschillende signaalroutes onderzoeken. In Hartz et al. 21, vonden we dat de peptide endothelin-1 snel en omkeerbaar verminderd P-gp vervoer functie in de haarvaten van de hersenen door te handelen via de endothelin receptor B (ETB) receptor, stikstofoxide synthase (NOS) en proteïne kinase C, (PKC). In Bauer et al. 19, we toonden expressie van de nucleaire receptor pregnane X receptor (PXR) en toonde PXR-modulatie van P-gp expressie en vervoer functie in de haarvaten van de hersenen. In experimenten met transgene gehumaniseerd PXR muizen, we uitgebreid deze lijn van onderzoek en toonde in vivo aanscherping van het blok door upregulating P-gp via hPXR activering25. In 2010, Hartz et al. 26 gebruikt deze aanpak om te herstellen van P-gp eiwit expressie en vervoer van activiteit in transgene menselijke amyloïde precursor proteïne (hAPP) muizen die overexpress hAPP. Bovendien verminderd herstellen van P-gp in hAPP muizen aanzienlijk bèta amyloid (Aβ)40en Aβ42hersenen niveaus.
Naast het studeren signaalroutes, kunnen geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt voor het bepalen van de veranderingen in de capillaire permeabiliteit die wij capillaire lekkage noemen. In het bijzonder wordt de bepaling van de lekkage Texas Red gebruikt ter beoordeling van de lekkage van de fluorescente kleurstof Texas Red van de capillaire lumen in de tijd en deze gegevens worden vervolgens gebruikt voor het analyseren van lekkage tarieven. Verhoogde capillaire lekkage tarieven in vergelijking met die van controle haarvaten geven wijzigingen in de fysieke integriteit van de bloed - hersen barrière-2. Dit is waardevol, want er talrijke ziekte staten gekoppeld barrière ontwrichting, BV zijn., epilepsie, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer en traumatische hersenen letsel27,28,29, 30. Andere groepen hebben ook gebruikt voor geïsoleerde haarvaten te onderscheiden signaalroutes die eiwit expressie en vervoersactiviteit van proteïnen31,32,33,34regelen, 35,,36,,37. Tot slot, wij zijn blijven om het optimaliseren van deze methode voor de isolatie van menselijke hersenen haarvaten en onlangs, toonden wij verhoogde P-gp expressie op het menselijke bloed - hersenbarrière bij patiënten met epilepsie in vergelijking met inbeslagneming-gratis controle individuen38 . Samen genomen, tonen deze ontwikkelingen dat geïsoleerde hersenen haarvaten als een veelzijdig model om te studeren barrièrefunctie kunnen dienen.
Verschillende in vivo, ex vivoen in vitro de bloed - hersen barrière-modellen zijn gebruikt in basisonderzoek en industriële drug screening, hoofdzakelijk met het doel van de tests van de drug levering aan de hersenen39,40,41 ,42,43,44. Naast geïsoleerde ex vivo de haarvaten van de hersenen omvatten actuele modellen van de bloed - hersenbarrière in silico modellen, in vitro de cultuur van de cel van geïsoleerde capillaire endothelial hersencellen of vereeuwigd cellijnen uit verschillende soorten, in vitro cultuur van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) dat onderscheid in hersenen capillaire endotheliale cellen en microfluidic modellen op een chip.
In silico modellen zijn het meest gebruikt in Geneesmiddelenontwikkeling voor het selecteren van drugkandidaten op basis van het voorspelde absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) eigenschappen. Methoden zoals kwantitatieve structuur-eigenschap relatie (QSPR) en kwantitatieve structuur-activiteit relatie (QSAR) modellen zijn populaire methoden in high-throughput screening van bibliotheken gebruikt om te voorspellen hersenen penetratie van drugkandidaten 45 , 46. deze modellen zijn nuttig voor scherm moleculen voor barrière penetratie eigenschappen.
Betz et al. 47 opgericht monolayers van gekweekte capillaire endothelial hersencellen als een in vitro -systeem van het bloed - hersen barrière-model. In vitro cel cultuur modellen met behulp van vers weefsel of vereeuwigd endothelial cellijnen zoals menselijke cerebrale microvessel endotheliale cellen (hCMECs) kunnen een ander high-throughput screening hulpmiddel voor hersenen penetratie of mechanistische studies. Echter, hersenen capillaire endothelial cel cultuur modellen ontbreken de fysiologische schuifspanning van de bloedstroom in de capillaire lumen, zijn beperkt in het algemeen biologische complexiteit en ondergaan veranderingen in expressie en lokalisatie van belangrijke barrière onderdelen zoals tight junction eiwitten kanalen oppervlakte receptoren, vervoerders, enzymen en ion48,49,50. Omgekeerd, endotheel monolayers afgeleid van hPSCs, hebben lage sacharose permeabiliteit in vergelijking met hCMEC/D3 culturen en gepolariseerde expressie van sommige vervoerders van de bloed - hersen barrière, celadhesie-moleculen en strakke kruispunten51, bevatten 52. echter deze cellen ook onderhevig is aan veranderende eigenschappen in de cultuur, en het systeem moet worden gevalideerd voor haar recapitulatie van in vivo barrière eigenschappen52.
Nieuwere tendensen in de bloed - hersenbarrière onderzoek omvatten met behulp van 3D weefselkweek systemen tot kunstmatige haarvaten, met behulp van de orgel-op-spaander technologie voor het genereren van microfluidic apparaten, of met behulp van de holle vezel technologie53, 54 , 55. kunstmatige haarvaten, hebben echter aanzienlijk grotere diameters (100 – 200 µm) dan hersenen haarvaten (3-7 µm). Vandaar, de shear krachten in vitro doen niet volledig lijken op de in vivo situatie. Dit wordt behandeld in "blood-brain-barrier-on-a-chip" microfluidic apparaten, waar kunstmatige membranen formulier "bloed" en "brein" compartimenten en vloeistoffen door deze apparaten genereren microfluidic shear krachten worden gepompt. Ook zijn mede culturen van endotheliale cellen in verschillende combinaties met astrocyten en vasculaire zachte spiercellen ook gebruikt met de holle vezel technologie te herscheppen Rheologische parameters aanwezig onder in vivo voorwaarden56 , 57 , 58. het is echter onduidelijk hoe goed dit model dat andere eigenschappen van de bloed - hersenbarrière zoals vervoer, metabolisme, signalering en anderen weerspiegelt. Deze kunstmatige capillair en chip modellen zijn geschikt voor high-throughput screening van drugs, maar de cellen die worden gebruikt voor het genereren van deze modellen kunnen ook worden gewijzigd tijdens de cultuur.
Bevroren en vaste hersenen segmenten of primaire hersenen capillaire endothelial celculturen zijn extra modellen die kunnen worden gebruikt voorhet bestuderen van de menselijke microvasculature5,59,60,,61. Bijvoorbeeld, immunohistochemistry van vaste hersenweefsel wordt gebruikt om te bepalen eiwit lokalisatie en expressie in gezonde vergeleken met zieke weefsel.
Naast weefsel segmenten en de in vitro -modellen kunnen zoals hierboven beschreven, vers geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt om het bestuderen van de bloed - hersenbarrière functie. Beperkingen van dit geïsoleerde capillaire model omvatten de moeilijkheid om op te halen van de verse menselijk hersenweefsel, afwezigheid van neuronen, astrocyten en een relatief tijdrovend isolatie-proces. Een voordeel van het geïsoleerde hersenen capillaire model is dat dit model veel overeenkomsten vertoont met de situatie in vivo en daarom kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de barrièrefunctie en dysfunctie. Nog belangrijker is, kan het ook worden gebruikt om te onderscheiden van signalering mechanismen met behulp van een veelheid aan tests en moleculaire technieken3,19,62,,63.
Ons laboratorium heeft toegang tot beide verse en diepgevroren menselijk hersenweefsel door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M)64. In dit verband lijkschouwingen volgen een standaardprotocol, hersenen worden verkregen < 4 h, en alle procedures in overeenstemming zijn met de NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Deze unieke toegang krijgen tot menselijk hersenweefsel, wij opgericht en een protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel die in een hoog rendement van intact, haalbare menselijke hersenen haarvaten resulteert geoptimaliseerd. Twee gemeenschappelijke eindpunten van belang zijn de eiwituitdrukking en activiteit te bepalen. In dit verband hebben wij en anderen verschillende tests die kunnen worden gebruikt met geïsoleerde hersenen haarvaten aan studie eiwit expressie en activiteitenniveaus vastgesteld. Deze testen omvatten westelijke bevlekken, eenvoudige Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), zymography, vervoer activiteit testen, en capillaire lekkage testen. Deze tests kunnen onderzoekers te bestuderen veranderingen in functie als barrière in menselijke pathologische voorwaarden, trajecten waaraan eiwit expressie en activiteit te bepalen, en identificeren van farmacologische doelstellingen voor de behandeling van de bloed - hersen barrière gekoppeld ziekten.
Genomen samen, vers geïsoleerde hersenen haarvaten kunnen dienen als een robuuste en reproduceerbare model van de bloed - hersenbarrière. Vooral, kan dit model worden gecombineerd met veel verschillende testen om te bepalen van een breed scala van eindpunten te bestuderen barrièrefunctie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Inzicht in functie van de bloed - hersenbarrière fysiologische en pathofysiologische omstandigheden is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die de belofte houdt verbeteren hersenen drug, verbetering van de bescherming van de hersenen, en behandelen van hersenen stoornissen. Echter, het bestuderen van de menselijke bloed - hersen barrière-functie is uitdagend. Dus, is er een cruciale behoefte aan passende modellen. In dit verband vertegenwoordigen hersenen haarvaten geïsoleerd van menselijk hersenweefsel een uniek instrument om te studeren barrièrefunctie als dicht bij de mens in vivo situatie mogelijk. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de haarvaten van menselijk hersenweefsel op een hoog rendement en met constante kwaliteit en zuiverheid. Haarvaten zijn geïsoleerd uit verse menselijk hersenweefsel met mechanische homogenisering, dichtheid-verloop centrifugeren en filtratie. Na het isolement, kunnen de haarvaten van het menselijk brein worden gebruikt voor diverse toepassingen waaronder lekkage testen, levende cel imaging en immuun-gebaseerd testen aan studie eiwit expressie en functie, enzymactiviteit of intracellulaire signalering. Geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten zijn een uniek model voor het ophelderen van de regulering van de functie van menselijk bloed - hersenbarrière. Dit model kan inzicht verwerven in het centrale zenuwstelsel (CNS) pathogenese, die bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën helpen zal voor de behandeling van aandoeningen van de CNS.

De isolatie van menselijk hersenweefsel opbrengst een schorsing in menselijke hersenen haarvaten (figuur 1B) verrijkt met kleine hoeveelheden van grotere schepen, rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en enkele cel puin. Sommige haarvaten zijn vertakt en, in sommige, rode bloedcellen zijn gevangen in de capillaire lumen. Het typische capillair heeft een diameter van 3 – 7 µm en is ongeveer 100-200 µm lang met open lumen; meeste capillaire eindigt ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dubbele Fluorescentie In situ Hybridisatie in Fresh Brain secties

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo&#39;s voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Een Model van de Rat van milde uteriene hypoperfusie met Microcoil stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...