Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
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Wir danken und Dr. Peter Nelson und Sonya Anderson in der UK-ADC Brain Tissue Bank für die Bereitstellung aller menschlichen Gehirns Gewebeproben anerkennen (NIH grant Nummer: P30 AG028383 vom National Institute on Aging). Wir danken Matt Hazzard und Tom Dolan, Universität von Kentucky, Information Technology Services, akademischen Technologie und Fakultät Engagement für grafische Unterstützung. Dieses Projekt wurde von Grant Nummer 1R01NS079507 vom National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (um b.b.) und Nummer 1R01AG039621 Zuschuss aus dem National Institute on Aging (zu A.M.S.H.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall oder das National Institute on Aging. Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die nachstehenden Informationen basiert auf aktuellen Sicherheits- und Regulierungsstandards an der University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Als Vorsichtsmaßnahme beziehen sich auf die Institution biologische Sicherheitsprogramm und den aktuellsten Vorschriften und Empfehlungen vor der Arbeit mit menschlichem Gewebe.
Achtung: Menschliches Gewebe kann eine Quelle von Blut übertragene Krankheitserreger, einschließlich Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B-Virus (HBV) und Hepatiti...

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakt und lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren aus frischem Gewebe. In diesem Abschnitt besprechen wir im Detail Folgendes: (1) Änderungen des Protokolls, 2) Problembehandlung für häufige Fehler, (3) die Grenzen der Technik, (4) die Bedeutung des Modells im Hinblick auf bestehende und alternative Blut - Hirn-Schranke-Modelle, und 5). Einsatzmöglichkeiten für isolierte Gehirn-Kapillaren.
Das hier beschriebene Protokoll ist für 10 g fri...

Die Blut - Hirn-Schranke ist eine streng kontrollierte Schnittstelle zwischen Blut und Gehirn, der bestimmt, was geht in und aus dem Gehirn heraus kommt. Anatomisch, Endothelzellen der Blut - Hirn-Schranke zu komponieren und bildet eine komplexe, durchgehende kapillarnetzes. Physiologisch, versorgt dieses engmaschiges Netz das Gehirn mit Sauerstoff und Nährstoffen während gleichzeitig Entsorgung von Kohlendioxid und Abfallprodukte des Stoffwechsels. Wichtig ist, unterstützt Beweise, dass die Änderungen an der Schranke zu zahlreichen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Epilepsie und Schlaganfall1,2,3,4,5 beitragen , 6 , 7. Gehirn endotheliale Zellen auch als ein Hindernis für die Behandlung dienen durch die Blockierung der Droge Aufnahme ins Gehirn, zB., Chemotherapie von Glioblastoma Multiforme nach Tumor Resektion8,9, 10. In diesem Zusammenhang isolierte Gehirn-Kapillaren stellen eine einzigartige ex Vivo Blut - Hirn-Schranke Modell, das Barriere Eigenschaften in-vivo, ähnelt die für das Studium der Barriere-Funktion und Dysfunktion im Gesundheitswesen ermöglicht und Krankheit. In diesem Artikel bieten wir ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren vom menschlichen Gehirn auf eine gleichbleibend hohe Qualität der Kapillare zu isolieren und Ertrag um die Blut - Hirn-Schranke zu studieren.
Im Jahr 1969 Siakotos Et Al. 11 waren die ersten, die Isolation der Gehirn-Kapillaren aus Rind- und menschlichen Hirngewebe mit Steigung Zentrifugierung und Glas Bead Spalte dichtetrennung zu melden. Später, Goldstein Et al. 12 verbessert diese Methode, indem mehrere filtrationsschritte verringern die Menge des Gewebes erforderlich, Gehirn-Kapillaren von Ratten, unter Beibehaltung der Stoffwechselaktivität der Glukose Transport isoliert zu studieren. Seitdem optimiert Forscher die Kapillare Isolierung Verfahren mehrfach, Verbesserung der Methode und des Gehirns Kapillaren Modells mit jeder Iteration13,14,15. Z. B. Pardridge Et Al. 16 bovine Kapillaren mit enzymatischen Verdauung anstelle mechanischer Homogenisierung isoliert, und dann anschließend eine Kapillare Suspension durch ein Filtersieb 210 µm und eine Glassäule Wulst. Diese Änderungen verbessert den Trypan blau Ausgrenzung Fleck isolierte Gehirn-Kapillaren und so erhöhte endotheliale Zellviabilität. Anfang der 1990er Jahre Dallaire Et Al. 17 isoliert Rindern und Ratte Kapillaren, die waren frei von neuronalen Kontamination und metabolische Aktivität der γ-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTase) und alkalische Phosphatase gepflegt. Im Jahr 2000 Miller Et Al. 18, verwendet isolierten Ratten und Schweinen Gehirn Kapillaren in Kombination mit konfokalen Mikroskopie um zu zeigen, die Anhäufung von Transport-Substrate in das Lumen der Kapillaren. Anschließend haben unser Labor hat weiterhin das Gehirn Kapillare Isolierung Verfahren zu optimieren und wir Transport Tests ermitteln, P-Glykoprotein (P-Gp)19,20,21, Brustkrebs Widerstand Protein (BCRP)22,23und Multi-Drug Resistance Protein 2 (Mrp2)24 Transportaktivität. Im Jahr 2004 veröffentlichten wir zwei Berichte wo wir isolierte Ratte Gehirn Kapillaren verwendet, um verschiedene Signalwege zu untersuchen. In Hartz Et Al. 21, fanden wir, dass das Peptid Endothelin-1 schnell und reversibel P-Gp Transportfunktion im Gehirn Kapillaren durch Einwirkung durch Endothelin-Rezeptor B (ETB) Rezeptor, Stickoxid-Synthase (NOS) und Proteinkinase C (PKC) reduziert. In Bauer Et al. 19, haben wir bewiesen, Ausdruck des nuklearen Rezeptoren Pregnane X-Rezeptors (PXR) und zeigte PXR-Modulation des P-Gp Ausdruck und Transport-Funktion im Gehirn-Kapillaren. In Experimenten mit transgenen Mäusen, humanisierter PXR wir diese Linie der Forschung erweitert und zeigte in Vivo Verschärfung der Barriere von heraufregulierende P-Gp durch hPXR Aktivierung25. Im Jahr 2010 Hartz Et Al. 26 verwendet diesen Ansatz zur Wiederherstellung von P-Gp-Protein-Expression und Aktivität in transgenen menschlichen Amyloid-Precursor-Protein (hAPP)-Mäuse, die hAPP overexpress zu transportieren. Darüber hinaus reduziert Wiederherstellung des P-Gp in hAPP Mäuse Beta-Amyloid (Aβ)40und Aβ-42-Gehirn-Spiegel.
Neben dem Studium Signalwege, lässt die isolierte Gehirn-Kapillaren Veränderungen in Kapillare Permeabilität bestimmen, welche wir als Kapillare durchsickern bezeichnen. Insbesondere dient der Texas Red-Leckage-Test zur Bewertung Austreten von der Fluoreszenzfarbstoff Texas Red aus der Kapillare Lumen über Zeit und diese Daten werden verwendet, um die Leckraten zu analysieren. Verstärkte Kapillare Leckraten im Vergleich zu denen von Kontrolle Kapillaren anzugeben Änderungen in die körperliche Integrität der Blut - Hirn-Schranke2. Dies ist wertvoll, denn es zahlreiche Krankheitszustände Barriere Störung, z.B.zugeordnet gibt., Epilepsie, Multiple Sklerose, Alzheimer-Krankheit und Schädel-Hirn Verletzungen27,28,29, 30. Andere Gruppen haben auch isolierte Kapillaren um Signalwege zu erkennen, die Protein-Expression und Transportaktivität Proteine31,32,33,34regulieren genutzt, 35,36,37. Schließlich haben wir diese Methode für die Isolierung der Kapillaren des menschlichen Gehirns zu optimieren und, vor kurzem, wir zeigten erhöhte P-Gp Ausdruck im menschlichen Blut - Hirn-Schranke bei Patienten mit Epilepsie im Vergleich zu anfallsfrei Kontrolle38 . Zusammengenommen zeigen diese Entwicklungen, dass isolierte Gehirn-Kapillaren als ein vielseitiges Modell Barrierefunktion studieren dienen können.
Verschiedenen in vivo, ex-Vivound in Vitro Blut - Hirn-Schranke-Modelle wurden in Grundlagenforschung und der industriellen Drogentest, vor allem mit dem Ziel der Drug-Delivery zum Gehirn39,40,41 Tests verwendet ,42,43,44. Neben isolierten ex Vivo Gehirn-Kapillaren sind aktuelle Modelle der Blut - Hirn-Schranke in Silico Modelle, in Vitro Zellkultur von isolierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen oder immortalisierte Zelllinien aus verschiedenen Arten, in-vitro- Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC), die in Kapillare endothelial Zellen des Gehirns und mikrofluidischen Modelle auf einem Chip zu differenzieren.
In Silico Modelle sind am häufigsten in der Medikamentenentwicklung verwendet, für die Auswahl von Arzneimittelkandidaten anhand der prognostizierten Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) Eigenschaften. Methoden wie quantitative Struktur-Eigenschaft Beziehung (QSPR) Modelle und quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (QSAR) Modelle sind beliebte Methoden im Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken, Gehirn Eindringen von Wirkstoffkandidaten vorauszusagen 45 , 46. diese Modelle eignen sich zur Bildschirm-Moleküle für Barriereeigenschaften eindringen.
Betz Et al. 47 Monolagen der kultivierten Gehirn Kapillare endothelial Zellen als ein in-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modellsystem etabliert. In-vitro- Kultur zellmodelle mit frischem Gewebe oder verewigt endotheliale Zell-Linien wie menschlichen zerebralen kapilläre Endothelzellen (hCMECs) können ein weiteres Hochdurchsatz-Screening-Tool für Gehirn eindringen oder mechanistische Studien sein. Jedoch Gehirn Kapillare endothelial Zelle Kultur Modelle fehlen die physiologischen Scherspannung des Blutflusses in der Kapillare Lumen, sind in ihrer gesamten biologischen Komplexität begrenzt und Veränderungen in Ausdruck und Lokalisierung der Hindernis-Komponenten wie tight Junction Proteinen Kanäle Oberfläche Rezeptoren, Transporter, Enzyme und Ionen-48,49,50. Umgekehrt, endotheliale Monolagen abgeleitet hPSCs, niedrigen Saccharose Durchlässigkeit im Vergleich zu hCMEC/D3 Kulturen und enthalten polarisierte Ausdruck einige Blut - Hirn-Schranke Transporter, Adhäsionsmoleküle und tight Junctions51, 52. allerdings diese Zellen unterliegen ebenfalls ändern Eigenschaften in der Kultur, und das System muss für die Reprise des in Vivo Barriere Eigenschaften52validiert werden.
Neuere Trends in der Blut - Hirn-Schranke Forschung umfassen unter Verwendung 3D Zellkultur Systeme schaffen künstliche Kapillaren, mit der Orgel-on-Chip-Technologie um mikrofluidischen Geräte verursachen, oder unter Verwendung der Hohlfaser-Technologie53, 54 , 55. künstliche Kapillaren haben jedoch deutlich größere Durchmesser (100 – 200 µm) als Gehirn-Kapillaren (3 – 7 µm). Daher ähneln die Schere Kräfte in Vitro nicht vollständig die in-Vivo -Situation. Dies richtet sich in "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrofluidischen Geräten, wo künstliche Membranen Form "Blut" und "Gehirn" Fächern und Flüssigkeiten durch diese Geräte erzeugen mikrofluidischen Scherkräfte gepumpt werden. In ähnlicher Weise wurden ko-Kulturen von Endothelzellen in verschiedenen Kombinationen mit Astrozyten und vaskulären glatten Muskelzellen auch mit der Hohlfaser-Technologie zur rheologischen Parameter unter in Vivo Bedingungen56 neu , 57 , 58. es ist jedoch unklar, wie gut dieses Modell andere Eigenschaften die Blut - Hirn-Schranke, wie Transport, Stoffwechsel, Signalisierung und andere reflektiert. Diese künstliche Kapillare und Chip-Modelle eignen sich für Hochdurchsatz-Screening von Drogen, aber die Zellen zur Erzeugung von diesen Modells vorbehalten auch während der Kultur.
Gefrorene und festen Gehirnscheiben oder primäre Gehirn, die Kapillare endothelial Zellkulturen sind weitere Modelle, dieStudie der menschlichen Microvasculature5,59,60,61genutzt werden können. Zum Beispiel Immunohistochemistry von festen Hirngewebe dient zur Bestimmung von Protein-Lokalisierung und Ausdruck in gesunden im Vergleich zu erkranktem Gewebe.
Neben Gewebe Scheiben und die in-vitro- Modelle können oben beschrieben, frisch isolierte Gehirn-Kapillaren genutzt werden, um die Funktion der Blut - Hirn-Schranke zu untersuchen. Einschränkungen dieses isolierte Kapillare Modells umfassen die Schwierigkeit zu frischem menschlichen Hirngewebe, Abwesenheit von Astrozyten und Neuronen und eine relativ aufwändige Isolierung Prozess. Ein Vorteil der Kapillare isolierte Gehirn-Modells ist, dass dieses Modell die in-Vivo -Situation ähnelt und daher verwendet werden, kann um die Barriere-Funktion und Dysfunktion zu charakterisieren. Wichtig ist, kann auch verwendet werden, zu erkennen, Signalisierung Mechanismen, die mit einer Vielzahl von Tests und Verfahren der molekularen3,19,62,63.
Unser Labor hat Zugang zu beiden frischen und gefrorenen menschlichen Hirngewebe durch die Sanders-Brown-Center on Aging (IRB #B15-2602-M)64. In diesem Zusammenhang Autopsien folgen ein Standardprotokoll, Gehirne erhalten in < 4 h und alle Verfahren entsprechen den Best Practices von NIH Ibbl65. Angesichts dieser einzigartigen Zugang zum menschlichen Hirngewebe, wir eingerichtet und optimiert ein Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu isolieren, der eine hohe Ausbeute an intakten, lebensfähigen menschlichen Gehirns Kapillaren führt. Zwei gemeinsame Endpunkte von Interesse sind die Protein-Expression und Aktivität zu bestimmen. In diesem Zusammenhang haben wir u.a. verschiedene Assays etabliert, die mit isolierte Gehirn-Kapillaren verwendet werden können, um Protein-Expression und Aktivität zu studieren. Diese Tests umfassen, Western blotting, einfache Western-Assay, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Zymography, Transport-Aktivität-Assays, und Kapillare durchsickern Assays. Diese Tests erlauben Forschern Änderungen in Barriere-Funktion im menschlichen pathologischen Bedingungen zu studieren, bestimmen Signalwege, die Protein-Expression und Aktivität zu regieren und ermitteln pharmakologische Ziele für die Behandlung von Blut - Hirn-Schranke verbunden Krankheiten.
Frisch zusammen genommen können isolierte Gehirn-Kapillaren als stabile und reproduzierbare Modell der Blut - Hirn-Schranke dienen. Dieses Modell ist vor allem, mit vielen verschiedenen Assays zu bestimmen, eine breite Palette von Endgeräten, Barrierefunktion zu studieren kombinierbar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Verständnis-Blut - Hirn-Schranke-Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ist entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, die halten das Versprechen Gehirn Drug-Delivery, Gehirn-Schutz zu verbessern, und Gehirn zu behandeln Störungen. Studium der menschlichen Blut - Hirn-Schranke-Funktion ist jedoch schwierig. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für geeignete Modelle. In diesem Zusammenhang vertreten Gehirn Kapillaren isoliert aus menschlichen Hirngewebe ein einzigartiges Werkzeug, Barriere-Funktion als in der Nähe der menschlichen in-Vivo -Situation wie möglich zu studieren. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe zu eine hohe Ausbeute und mit gleichbleibender Qualität und Reinheit zu isolieren. Kapillaren sind aus frischen menschlichen Gehirngewebe mit mechanischer Homogenisierung, Dichtegradienten Zentrifugation und Filtrierung isoliert. Nach der Isolierung können die menschliche Gehirn-Kapillaren für verschiedene Anwendungen einschließlich Leckage-Assays, live Cell Imaging und Immune basierende Assays verwendet werden, Protein-Expression und Funktion, Enzym-Aktivität oder intrazellulären Signalisierung zu studieren. Isolierte Gehirn-Kapillaren sind ein einzigartiges Modell die Verordnung der menschlichen Blut - Hirn-Schranke Funktion aufzuklären. Dieses Modell bieten Einblicke in die Pathogenese der zentralen Nervensystems (ZNS), die die Entwicklung von Therapiestrategien zur Behandlung von CNS Störungen helfen.

Die Isolationen aus menschlichen Hirngewebe ergeben eine Suspension im menschlichen Gehirn Kapillaren (Abbildung 1 b) angereichert mit geringen Mengen an größere Schiffe, rote Blutkörperchen, andere Einzelzellen und einige zellenrückstand. Einige Kapillaren verzweigt sind, und in einigen, roten Blutkörperchen in den Kapillaren Lumen gefangen sind. Die typische Kapillare hat einen 3 – 7 µm Durchmesser und ist etwa 100-200 µm lang mit offenen Lumen; di...

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Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

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Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

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The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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