Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

ואנו מכירים ד ר פיטר נלסון, סוניה אנדרסון מהבנק רקמת המוח בבריטניה-ADC למתן כל המוח האנושי דגימות רקמה (NIH להעניק מספר: P30 AG028383 מן המכון הלאומי לזיקנה). אנו מודים האזרד מאט, טום דולאן, שירותי טכנולוגיית מידע, טכנולוגיה אקדמי, סגל האירוסין, אוניברסיטת קנטאקי לסיוע גרפי. פרויקט זה נתמך על ידי מענק 1R01NS079507 מספר מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו (כדי B.B.) ועל ידי גרנט 1R01AG039621 מספר מן המכון הלאומי לזיקנה (כדי A.M.S.H.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמי של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו או המכון הלאומי על הזדקנות. המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המידע שלהלן מבוסס על תקני הרגולציה ב אוניברסיטת קנטאקי, בלקסינגטון, KY, ארה ב ובטיחות הנוכחי. כאמצעי בטיחות, עיין תוכנית בטיחות ביולוגית של המוסד ועל תקנות העדכני ביותר ואת המלצות לפני שעבדה עם רקמה אנושית.
התראה: רקמה אנושית יכולה להיות מקור של נישא בדם פתוגנים, כולל וירוס הכ...

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של נימי הדם במוח האדם ללא שינוי בר -קיימא מרקמות טריים. בסעיף זה, נדון בפירוט את הפעולות הבאות: 1) שינויים בפרוטוקול, 2) פתרון בעיות של שגיאות נפוצות, 3) מגבלות של הטכניקה, 4) המשמעות של המודל ביחס הקיימת לבין מודלים חלופיים שיטת, ו- 5). יישומים אפשריים עבור המוח האנ...

מחסום הדם - מוח הוא ממשק פיקוח הדוק בין הדם לבין המוח שקובע מה נכנס ומה יצא המוח. מבחינה אנטומית, תאי אנדותל להלחין את מחסום הדם - מוח וצורות מורכבות, רציף לרשת הנימים. מבחינה פיזיולוגית, רשת נימי זו מספקת את המוח עם חמצן וחומרים מזינים בזמן בו זמנית חיסולו של פחמן דו-חמצני, חומרי פסולת מטבולית. חשוב לציין, ראיה תומכת כי השינויים המכשול לתרום פתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, שבץ מוחי1,2,3,4,5 , 6 , 7. המוח תאי אנדותל גם לשמש מחסום לטיפול על ידי חסימת ספיגת התרופה לתוך המוח, למשל., כימותרפיה של גליובלסטומה בעקבות הגידול כריתה8,9, 10. בהקשר זה, המוח האנושי מבודד נימים מייצגים ייחודי שמחוץ מחסום הדם - מוח מודל הדומה מכשול מאפיינים ויוו, מה שמאפשר עבור המחקר של המכשול ותפקוד לקוי בבריאות ומחלות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול לבודד נימים המוח של המוח האנושי באיכות נימי בעקביות גבוהה, תשואה ללמוד את מחסום הדם - מוח.
בשנת 1969, Siakotos et al. 11 היו הראשונים לדווח את ניתוקה של נימי הדם במוח של רקמת המוח שור ואנושי שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה וזכוכית חרוז עמודה ההפרדה. גולדשטיין. מאוחר יותר, et al. 12 חל שיפור בשיטה זו על-ידי הוספת שלבים מרובים סינון כדי להקטין את כמות רקמת צריך ללמוד נימים המוח מבודד חולדות, תוך שמירה על פעילות חילוף החומרים של הגלוקוז תחבורה. מאז, חוקרים אופטימיזציה ההליך בידוד נימי פעמים רבות, שיפור המודל נימי שיטת והמוח עם כל איטרציה13,14,15. לדוגמה, Pardridge et al. 16 מבודד שור נימים באמצעות עיכול אנזימטי במקום מכני המגון ולאחר מכן עברה השעיה נימי דרך מסנן רשת מיקרומטר 210 ו עמודה חרוז זכוכית. לבצע שינויים אלה משופרת הכתם הדרה trypan blue של נימי הדם במוח מבודד, לפיכך, גדלה הכדאיות תא אנדותל. בתחילת שנות התשעים, Dallaire et al. 17 מבודדים נימים שור, חולדה היו ברורות של זיהום עצביים ומתוחזק פעילות חילוף החומרים של γ-glutamyl transpeptidase (וγ-GTase), אלקליין פוספטאז. בשנת 2000, מילר ואח. 18, המשמש עכברוש מבודד, המוח חזירי נימים בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית להראות ההצטברות של סובסטרטים תחבורה לתוך לומן של נימים. לאחר מכן, המעבדה שלנו ממשיכה לייעל את ההליך בידוד נימי המוח, הקמנו מבחני תחבורה כדי לקבוע P-גליקופרוטאין (P-gp)19,20,21, סרטן השד ההתנגדות חלבון (BCRP)22,23, ו רב תרופתיים חלבון 2 (Mrp2) פעילות תחבורה24 . בשנת 2004, פרסמו שני דוחות כאן היינו מבודדים עכברוש המוח נימים לחקור איתות המסלולים השונים. ב- Hartz ואח. 21, מצאנו כי ה-פפטיד endothelin-1 במהירות, הפיכה צמצם P-gp תחבורה פונקצית נימים המוח על ידי משחק דרך endothelin קולטן B (ETB) קולטן, תחמוצת החנקן סינתאז (NOS), חלבון קינאז C (PKC). ב. באוור et al. 19, להדגים ביטוי של הקולטן pregnane X קולטן גרעיניים (PXR), הראה PXR-אפנון של P-gp הביטוי ואמצעי התחבורה פונקציה של נימי הדם במוח. בניסויים עם העכברים הטרנסגניים PXR humanized, אנחנו הרחיבה את הקו הזה של מחקר והראו ויוו הידוק של המכשול באמצעות upregulating קולטני P-gp באמצעות הפעלת hPXR25. בשנת 2010 Hartz ואח. 26 להשתמש בגישה זו לשחזר P-gp חלבון ביטוי ולהעביר פעילות בעכברים חלבון (מא) הטרנסגניים קודמן עמילואיד אנושי זה overexpress בשמחה. יתר על כן, שחזור P-gp ב מא עכברים הקטינה באופן משמעותי עמילואיד ביתא (Aβ)40ו- Aβ42המוח רמות.
בנוסף למדתי איתות המסלולים, נימים המוח מבודדים ניתן לקבוע שינויים בחדירות נימי אשר אנו מתייחסים כאל זליגת נימי. בפרט, וזמינותו זליגת טקסס האדום משמש כדי להעריך את דליפת הפלורסנט טקסס האדום של לומן נימי לאורך זמן נתונים אלה משמשות לאחר מכן לנתח את זליגת המחירים. המחירים זליגת נימי מוגברת בהשוואה לאלו של שליטה נימים מצביעים על שינויים שלמות פיזית מחסום הדם - מוח2. זה חשוב כי יש מצבי מחלה רבים הקשורים עם מחסום הפרעה, למשל., אפילפסיה, טרשת נפוצה, אלצהיימר, מוח טראומטית פציעה27,28,29, 30. קבוצות אחרות גם נעזרו נימים מבודד להבחין איתות המסלולים המווסתים ביטוי חלבון ופעילות התחבורה של חלבונים31,32,33,34, 35,36,37. בסופו של דבר, המשכנו למטב את שיטה זו עבור בידודו של המוח האנושי נימים ו, לאחרונה, הראנו ביטוי מוגבר של P-gp-האדם מחסום הדם - מוח בחולים עם אפילפסיה בהשוואה לאנשים ללא פרכוס שליטה38 . התפתחויות אלה יחדיו, מדגימים כי המוח מבודדים נימים יכול לשמש מודל רב תכליתי ללמוד מכשול פונקציה.
שונים ויוו, ex-vivo, ומודלים במבחנה מחסום הדם - מוח שימשו מחקר בסיסי, תעשייתי והתרופות הקרנה, בעיקר עם המטרה של בדיקת משלוח הסמים המוח39,40,41 ,42,43,44. בנוסף מבודד שמחוץ נימים המוח, המודלים הנוכחיים של מחסום הדם - מוח כוללים סיליקו מודלים, במבחנה תרבית תאים של תאי אנדותל נימי המוח מבודדים או שורות תאים מונצחים מ שונים מינים, in vitro לקשרי תרבות של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) כי להבדיל לתוך תאי אנדותל נימי המוח, ומודלים microfluidic על שבב.
אין סיליקו מודלים משמשים בדרך כלל פיתוח תרופות לבחירת המועמדים סמים המבוסס על הקליטה החזוי, הפצה, חילוף החומרים ומאפיינים הפרשה (גלית נחמני). שיטות כגון מבנה כמותית-מאפיין יחסים (QSPR) מודלים ודגמים היחסים (QSAR) מבנה כמותית-פעילות הן השיטות הפופולריות בשימוש תפוקה גבוהה ההקרנה של ספריות לחזות המוח חדירה של מועמדים סמים 45 , 46. מודלים אלה שימושיים מסך מולקולות למאפייני חדירה מכשול.
Betz. et al. 47 נוסדה monolayers של תאי אנדותל נימי המוח מתורבתות כמו מערכת מודל מחסום הדם - מוח במבחנה . במבחנה תא תרבות מודלים באמצעות רקמות טריים או קווים מונצחים תא אנדותל כגון תאי אנדותל microvessel במוח האנושי (hCMECs) יכול להיות עוד כלי ההקרנה תפוקה גבוהה עבור המוח חדירה או מחקרים מכניסטית. עם זאת, של התרבות תאי אנדותל נימי מוח חסר גזירה הפיזיולוגיות של זרימת הדם בתוך נימי לומן מוגבלים בסיבוכיות הכולל וחיסונים, עוברים שינויים בביטוי, לוקליזציה של רכיבים חשובים מכשול כגון חלבונים צומת חזק, קולטנים משטח, שנאים, אנזימים, יון ערוצי48,49,50. לעומת זאת, monolayers אנדותל נגזר hPSCs, יש חדירות נמוכה סוכרוז לעומת תרבויות hCMEC/D3, מכילים את הביטוי מקוטב של מובילי מחסום הדם - מוח מסוימים, מולקולות אדהזיה צמתי צר51, 52. עם זאת, תאים אלה קיימת גם שינוי מאפיינים בתרבות, המערכת יש לאמת עבור שלה רפריזה ויוו מכשול מאפיינים52.
מגמות חדשות בחקר מחסום הדם - מוח כוללים ניצול מערכות תרביות רקמה תלת-ממד כדי ליצור נימים מלאכותי, באמצעות הטכנולוגיה איברים על שבב לייצר מכשירים microfluidic, או ניצול הטכנולוגיה הולופייבר53, 54 , 55. נימים מלאכותיים, עם זאת, יש קטרים גדולים משמעותית (200-100 מיקרומטר) מאשר המוח נימים (3-7 מיקרומטר). לפיכך, ההטיה כוחות במבחנה לא לגמרי דומים המצב ויוו . זה נשלח בהתקנים microfluidic "blood-brain-barrier-on-a-chip", שבו שאוב ממברנות מלאכותיות טופס "דם", "המוח" תאים ונוזלים דרך התקנים אלה לייצר כוחות גזירה microfluidic. באופן דומה, תרבויות המשנה של תאי אנדותל בשילובים שונים עם האסטרוציטים ותאים השריר החלק בכלי הדם היו בשימוש גם עם הטכנולוגיה הולופייבר ליצור מחדש נוכח תחת ויוו תנאים56 rheological פרמטרים , 57 , 58. עם זאת, לא ברור עד כמה המודל הזה משקף מאפיינים נוספים של מחסום הדם - מוח כגון תחבורה, חילוף החומרים, איתות, ואחרים. מודלים מלאכותיים אלה נים ו- chip מתאימים להקרנה תפוקה גבוהה של סמים, אבל התאים המשמש ליצירת מודלים אלה הם גם עשויים להשתנות במהלך תרבות.
פרוסות המוח מוקפאים ולא קבוע או מוח ראשוניים תא אנדותל נימי שהתרבויות דגמים נוספים יכול לשמש כדילחקור את microvasculature האנושית5,59,60,61. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה של רקמת המוח קבוע משמש לקביעת חלבון לוקליזציה, ביטוי בריא לעומת רקמות חולות.
בנוסף רקמת פרוסות הדגמים במבחנה המוח תוארו לעיל, טרי מבודד נימים יכול להיות מנוצל כדי לחקור פונקציה מחסום הדם - מוח. מגבלות של מודל נימי מבודד זה כוללים את הקושי להשיג רקמת המוח האנושי טריים, היעדר האסטרוציטים הנוירונים ואת תהליך בידוד יחסית זמן רב. יתרון של המודל נימי המוח מבודדים היא כי מודל זה הדומה המצב ויוו , לפיכך, יכול לשמש כדי לאפיין את מחסום ותפקוד לקוי. חשוב, זה יכול לשמש גם להבחין מנגנוני איתות באמצעות שפע של מבחני ו טכניקות מולקולריות3,19,62,63.
המעבדה שלנו יש גישה אל רקמת המוח האנושי טריים וקפואים שני דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ')64. בהקשר זה, בצע נתיחות שלאחר המוות פרוטוקול תקני, המוח מתקבלים ב < 4 שעות ולאחר כל ההליכים לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. בהתחשב גישה ייחודית זו רקמת המוח האנושי, אנו נוסדה, אופטימיזציה פרוטוקול לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי שתוצאתו תשואה גבוהה של נימי הדם במוח האדם ללא פגע, מעשית. שתי נקודות הקצה נפוץ עניין הן לקבוע את ביטוי חלבון ופעילות. בהקשר זה, אנו ואחרים הקימו מבחני שונות, יכול לשמש עם נימים המוח מבודדים ללמוד ביטוי חלבון ו רמות הפעילות. מבחני אלה כוללים סופג המערבי, מערביים פשוטים assay, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), zymography, מבחני פעילות תחבורה, ו מבחני זליגת נימי. מבחני אלה לאפשר לחוקרים ללמוד שינויים בתפקוד מכשול בתנאים פיפטות האדם לקבוע מסלולים המפקחים על ביטוי חלבון ופעילות, לזיהוי מטרות תרופתי לטיפול של מחסום הדם - מוח הקשורים מחלות.
נלקח יחד, טרי המוח מבודדים נימים יכולים לשמש כמודל לשחזור ועמיד של מחסום הדם - מוח. במיוחד, מודל זה יכול להיות משולב עם מבחני שונות רבות כדי לקבוע מגוון רחב של נקודות קצה ללמוד מכשול פונקציה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

הבנת מחסום הדם - מוח הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological הוא קריטי עבור הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות להחזיק את ההבטחה לשיפור משלוח סמים המוח, לשפר את המוח הגנה, מתייחסים המוח הפרעות. עם זאת, לומד את הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח הוא מאתגר. לפיכך, יש צורך קריטי עבור מודלים המתאימים. בהקשר זה, נימים המוח מבודדים מרקמות המוח האנושי מייצגים כלי ייחודי כדי ללמוד מכשול לתפקד קרוב המצב האנושי ויוו ככל האפשר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד נימים מרקמות המוח האנושי-תשואה גבוהה ועם איכות עקבית וטוהר. נימים מבודדים מרקמות המוח האנושי טריים באמצעות המגון מכני, צפיפות-הדרגה צנטריפוגה סינון. לאחר הבידוד הנימים המוח האנושי יכול לשמש ליישומים שונים כולל מבחני דליפה, הדמיה תא חי המבוסס על החיסון מבחני ללמוד ביטוי חלבון, פונקציה, פעילות אנזים או איתות תאיים. המוח האנושי מבודד נימים הם מודל ייחודי התירי ברגולציה של הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח. מודל זה יכול לספק תובנות לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) פתוגנזה, אשר יסייע לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית.

ומשום מרקמות המוח האנושי תשואות השעיה מועשר בתמציות המוח האנושי נימים (איור 1B) עם כמויות קטנות של כלי שיט גדולים יותר, תאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת תאים מסוימים. כמה נימים מסתעפות, ו, בחלק, תאי הדם האדומים הם לכודים בתוך נימי לומן. נימי טיפוסי יש ק...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

מודל עכברוש של זילוח תוך רחמי קלה עם היצרות Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...