Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Vi takke og erkjenner Dr. Peter Nelson og Sonya Anderson på UK-ADC hjernen vev Bank for å gi alle menneskelige hjerne vevsprøver (NIH gi nummer: P30 AG028383 fra National Institute on Aging). Vi takker Matt Hazzard og Tom Dolan, IT-tjenester, faglig teknologi og fakultetet engasjement, University of Kentucky for grafisk hjelp. Dette prosjektet ble støttet av grant nummer 1R01NS079507 fra National Institute av nevrologiske lidelser og slag (til bb) og gi nummer 1R01AG039621 fra National Institute on Aging (til A.M.S.H.). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institute av nevrologiske lidelser og slag eller National Institute on Aging. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Informasjonen nedenfor er basert på gjeldende sikkerhet og regulatoriske standarder ved University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Som en forholdsregel henvise til institusjonens biologiske sikkerhetskabinett programmet og nyeste regler og anbefalinger før du arbeider med menneskelig vev.
FORSIKTIG: Menneskelig vev kan være en kilde til blodbårne patogener, herunder humant immunsviktvirus (HIV), hepatitt B-viruset (HBV), hepatitt C-viruset (HCV) og andre. Arbeide med menneskelig vev medf?...

Nåværende protokollen beskriver isolering av intakt og levedyktig menneskelige hjerne kapillærer fra ferskt vev. I denne delen, vi diskutere i detalj følgende: 1) endringer protokollen, 2) feilsøking av vanlige feil, 3) begrensninger av teknikken, 4) betydningen av modellen med hensyn til eksisterende og alternative blod - hjerne barrieren modeller, og 5). potensielle søknader om isolerte menneskelige hjerne blodkar.
Protokollen beskrevet her er optimalisert for 10 g av friske menneskeli...

Blod - hjerne barrieren er en strengt kontrollert grensesnitt mellom blod og hjernen som bestemmer hva som går inn og kommer ut av hjernen. Anatomisk, endotelceller komponere blod - hjerne barrieren og danner en kompleks, kontinuerlig capillary nettverket. Fysiologisk, leverer denne capillary nettverket hjernen med oksygen og næringsstoffer mens samtidig avhending av karbondioksid og metabolske avfallsprodukter. Viktigere, støtter bevisene at endringene barrieren bidra til mange patologi, inkludert Alzheimers, epilepsi og strek1,2,3,4,5 , 6 , 7. hjernen endotelceller også tjene som en barriere til behandling ved å blokkere narkotika opptak inn i hjernen, f.eks., kjemoterapi for glioblastom multiforme etter svulst resection8,9, 10. I denne forbindelse isolert menneskelige hjerne blodkar representerer en unik ex vivo blod - hjerne barrieren modell som ligner barriere egenskaper i vivo, som muliggjør studiet av barriere funksjon og dysfunksjon i helse og sykdom. I denne artikkelen gir vi en protokoll for å isolere hjernen kapillærer fra menneskelige hjerne med konsekvent høy kapillær kvalitet og kapasitet til å studere blod - hjerne barrieren.
I 1969, Siakotos et al. 11 var først å rapportere isolering av hjernen kapillærer fra storfe og menneskelig hjernevev bruker tetthet gradert sentrifugering og glass bead kolonnen separasjon. Senere Goldstein et al. 12 forbedret denne metoden av tilføyer flere filtrering trinn for å redusere mengden vev for å studere hjernen kapillærene isolert fra rotter, stund holder på metabolsk aktivitet av glukose. Siden da optimalisert forskere kapillær isolasjon prosedyren mange ganger, forbedre metoden og hjernen kapillær modellen med hver iterasjon13,14,15. For eksempel Pardridge et al. 16 isolert bovin kapillærene bruke enzymatisk fordøyelsen i stedet for mekaniske homogenisering, og deretter gikk senere en kapillær suspensjon gjennom en 210 µm maske filter og et glass bead-kolonnen. Disse endringene forbedret trypan blå utelukkelse flekken av isolerte hjernen kapillærer, og dermed økt endothelial celle levedyktighet. Tidlig på 1990-tallet, Dallaire et al. 17 isolerte storfe og rotten kapillærene som var klare neuronal forurensning og vedlikeholdt metabolsk aktivitet γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) og alkalisk fosfatase. I 2000 Miller et al. 18, brukt isolert rotte og svin hjerne blodkar i kombinasjon med AC confocal mikroskopi vise akkumulering av transport underlag til lumen av kapillærer. Deretter vårt laboratorium har fortsatt å optimalisere hjernen kapillær isolasjon prosedyren og har nå etablert transport analyser for å avgjøre P-glykoprotein (P-gp)19,20,21, brystkreft motstand protein (BCRP)22,23og flere resistens protein 2 (Mrp2)24 transport aktivitet. I 2004 publiserte vi to rapporter der vi brukte isolert rotte hjernen kapillærer for å undersøke ulike signalveier. I Hartz et al. 21, vi fant at det peptid endothelin-1 raskt og reversibel redusert P-gp transport funksjon i hjerne blodkar handler gjennom endothelin reseptor B (ETB) reseptoren, nitrogenoksid syntase (NOS) og protein kinase C (PKC). I Bauer et al. 19, vi viste uttrykk for kjernefysisk reseptoren pregnane X reseptoren (PXR) og viste PXR-modulering av P-gp uttrykk og transport funksjon i hjerne blodkar. Eksperimenter med transgene humanized PXR mus, vi utvidet dette forskning og viste i vivo innstramming av barrieren av upregulating P-gp gjennom hPXR aktivisering25. I 2010, Hartz et al. 26 benyttet denne tilnærmingen å gjenopprette P-gp protein uttrykk og transportere aktivitet i transgene menneskelige amyloid forløper protein (hAPP) musene som overexpress hAPP. Dessuten redusert gjenoppretter P-gp i hAPP mus betydelig amyloid beta (Aβ)40og Aβ42hjernen nivåer.
I tillegg til studere signalveier, kan isolerte hjernen kapillærene brukes å finne endringer i kapillær permeabilitet som vi kaller kapillær lekkasje. Spesielt brukes Texas Red lekkasje analysen til å vurdere lekkasje av fluorescerende fargestoff Texas rødt fra kapillær lumen over tid og disse dataene brukes deretter til å analysere lekkasje priser. Endringene i fysiske integritet av blod - hjerne barrieren2indikerer økt kapillær lekkasje satsene sammenlignet med de fra kontroll kapillærer. Dette er nyttig fordi det er mange sykdomstilstander knyttet barriere avbrudd, f.eks., epilepsi, multippel sklerose, Alzheimers sykdom og traumatisk brain skader27,28,29, 30. Andre grupper har også utnyttet isolert kapillærer å tyde signalveier som regulerer protein uttrykk og transport aktivitet av proteiner31,32,33,34, 35,36,37. Til slutt, vi har fortsatt å optimalisere denne metoden for isolering av menneskelige hjerne blodkar, og nylig vi viste økt P-gp uttrykk på den menneskelige blod - hjerne barrieren hos pasienter med epilepsi sammenlignet med anfall-free kontroll enkeltpersoner38 . Samlet viser denne utviklingen at isolert hjernen kapillærene kan tjene som en allsidig modell for å studere barriere-funksjonen.
Ulike in vivo, ex vivo, og i vitro blod - hjerne barrieren modeller har blitt brukt i grunnforskning og industrielle narkotikarelaterte screening, hovedsakelig med mål om å teste stoffet levering til hjernen39,40,41 ,42,43,44. I tillegg til isolerte ex vivo hjernen kapillærene inkluderer blod - hjerne barrieren modellene i sili modeller, i vitro cellekultur av isolerte hjernen kapillær endotelceller eller udødeliggjort linjer fra ulike arter, i vitro kultur for menneskelig pluripotent stamceller (hPSC) som skiller i hjernen kapillær endotelceller og microfluidic modeller på en brikke.
I sili modeller brukes vanligvis i utviklingen for valg av narkotika kandidater basert på forventet absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon (ADME) egenskaper. Metoder som kvantitative struktur-egenskapen forholdet (QSPR) modeller og kvantitative struktur aktivitet forholdet (BLEVE) modeller er populære metoder som brukes i høy gjennomstrømming screening av bibliotekene for å forutsi hjernen penetrasjon av narkotika kandidater 45 , 46. disse modellene er nyttig å skjermen molekyler for barriere gjennomtrenging egenskaper.
Betz et al. 47 etablert monolayers av kultivert hjernen kapillær endotelceller som et i vitro blod - hjerne barrieren modell-system. In vitro celle kultur modeller med ferskt vev eller udødeliggjort endothelial cellelinjer som menneskelige hjerne microvessel endotelceller (hCMECs) kan være en annen høy gjennomstrømming screening verktøyet for hjernen penetrasjon eller mekanistisk studier. Imidlertid hjernen kapillær endothelial celle kultur modeller mangler fysiologiske skjær stress blodstrøm i kapillær lumen, begrenses i samlet biologiske kompleksitet og gjennomgå endringer i uttrykk og lokalisering av viktig barriere komponenter som tett krysset proteiner kanaler overflate reseptorer, transportører, enzymer og ion48,49,50. Derimot endotelial monolayers avledet fra hPSCs, har lav sukrose gjennomtrengelighet i forhold til hCMEC/D3 kulturer og inneholder polarisert uttrykk for noen blod - hjerne barrieren transportører, vedheft molekyler og stramt veikryss51, 52. imidlertid disse cellene er også underlagt endrer egenskapene i kultur, og systemet må valideres for sin recapitulation av i vivo barriere egenskaper52.
Nyere trender i blod - hjerne barrieren forskning omfatter utnytte 3D vev kultur systemene for å skape kunstige kapillærene, bruker orgel-on-chip teknologi til å generere microfluidic enheter, eller bruker hul fiber teknologi53, 54 , 55. kunstig kapillærene, men har betydelig større diameter (100-200 µm) enn hjerne blodkar (3 – 7 µm). Derfor, den skjær krefter i vitro ikke fullt ligner situasjonen i vivo . Dette er adressert i "blood-brain-barrier-on-a-chip" microfluidic enheter, hvor kunstige membraner skjemaet "blood" og "hjernen" rom og væsker er pumpet gjennom disse enhetene generere microfluidic skjær styrker. Tilsvarende har co kulturer av endotelceller i forskjellige kombinasjoner med astrocyttene og vaskulær glatte muskelcellene også blitt brukt med hul fiber teknologi for å gjenskape reologiske parametere finnes under i vivo forhold56 , 57 , 58. men det er uklart hvor godt denne modellen gjenspeiler andre egenskaper for blod - hjerne barrieren som transport, metabolisme, signalnettverk, og andre. Disse kunstige kapillære og chip modeller er egnet for høy gjennomstrømming screening av narkotika, men cellene som brukes til å generere disse modellene er også endres under kultur.
Frosne og fast hjernen skiver eller primære hjernen kapillær endothelial cellekulturer er flere modeller som kan brukes til åstudere den menneskelige microvasculature5,59,60,61. For eksempel immunhistokjemi av faste hjernevev brukes til å bestemme protein lokalisering og uttrykk i sunt forhold til syke vev.
I tillegg til vev skiver og modeller i vitro kan beskrevet ovenfor, fersk isolert hjernen kapillærene benyttes for å studere blod - hjerne barrieren funksjon. Begrensninger av denne isolert kapillær modellen omfatter vanskelighetsgrad å få frisk hjernevev, fravær av astrocyttene og neurons, og en relativt tidkrevende isolasjon prosess. En fordel med isolert hjernen kapillær modellen er at denne modellen ligner situasjonen i vivo , og derfor kan brukes til å karakterisere barriere funksjon og dysfunksjon. Viktigere, kan den også brukes til å skjelne signalnettverk mekanismer ved hjelp av en rekke analyser og molekylære teknikker3,19,62,63.
Vårt laboratorium har tilgang til både fersk og frossen menneskelige hjernevevet via Sanders-brun Center på aldring (IRB #B15-2602-M)64. I denne sammenheng obduksjoner følger en standardprotokoll, hjernen er oppnådd i < 4 h, og alle prosedyrer overholder NIH Biospecimen beste praksis retningslinjer65. Gitt dette unik tilgang til hjernevev, vi etablert og optimalisert en protokoll for å isolere hjernen kapillærer fra hjernevev som resulterer i en høy avkastning av intakt, levedyktig menneskelige hjerne blodkar. To vanlige endepunktene av interesse er å bestemme protein uttrykk og aktivitet. I denne forbindelse, har vi og andre etablert ulike analyser som kan brukes med isolert hjernen kapillærene protein uttrykk og aktivitetsnivå. Disse analyser inkluderer vestlige blotting, enkel Western analysen, enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA), omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR), kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR), zymography, transport aktivitet analyser, og kapillær lekkasje analyser. Disse analyser tillate forskere å studere endringer i barriere-funksjonen i menneskelige patologisk forhold, finne veier protein uttrykk og aktivitet, og identifisere pharmacologic mål for behandling av blod - hjerne barrieren forbundet sykdommer.
Tatt sammen, fersk isolert hjernen kapillærene kan tjene som en robust og reproduserbar modell av blod - hjerne barrieren. Spesielt kan denne modellen kombineres med mange ulike analyser for å avgjøre en rekke endepunktene å studere barriere-funksjonen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Forståelse blod - hjerne barrieren funksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold er avgjørende for utvikling av nye strategier som holder løftet om å forbedre hjernen stoffet levering, forbedre hjernen beskyttelse og behandle hjernen lidelser. Det er imidlertid utfordrende å studere funksjonen menneskelig blod - hjerne barrieren. Dermed er det et kritisk behov for aktuelle modeller. I denne forbindelse representerer hjernen kapillærene isolert fra hjernevev et unikt verktøy å studere barriere funksjon som nær menneskelige i vivo situasjonen som mulig. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for å isolere kapillærer fra hjernevev på en høy avkastning og konsistent kvalitet og renhet. Kapillærene er isolert fra friske menneskelige hjernevev mekanisk homogenisering, tetthet-gradient sentrifugering og filtrering. Etter isolasjon, kan menneskelige hjerne kapillærene brukes til forskjellige programmer, inkludert lekkasje analyser, levende celle imaging og immun-baserte analyser for å studere protein uttrykk og funksjon, enzym aktivitet eller intracellulær signalering. Isolert menneskelige hjerne kapillærene er en unik modell å belyse regulering av funksjonen menneskelig blod - hjerne barrieren. Denne modellen kan gi innsikt i sentralnervesystemet (CNS) patogenesen, som vil bidra til utviklingen av strategier for behandling av CNS lidelser.

Isolasjoner fra hjernevev gi en suspensjon beriket i menneskelige hjerne blodkar (figur 1B) med små mengder større fartøy, røde blodlegemer, andre enkeltceller og noen celle rusk. Noen kapillærene er forgrenet, og i noen, røde blodlegemer er fanget i kapillær lumen. Den typiske kapillær 3 – 7 µm og diameteren er ca 100-200 µm lang med åpne lumen; de fleste kapillær ender er skjult. Bruke AC confocal mikroskopi, avsløre isolerte menneskelige hje...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillærer fra friske menneskelige hjernevev

Isolert hjernen kapillærer fra hjernevev kan brukes som prekliniske modell for å studere barriere funksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for å isolere hjernen kapillærer fra friske menneskelige hjernevev.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder for å studere nevrale morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation i Embryonic murin Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk Implantasjon for kronisk Optogenetic Stimulering av hjernevev

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av spinalvæske fra Rodent embryo for bruk med dissekert Cerebral Kortikale explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolasjon og kultur av endotelceller fra Embryonale brain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Isolasjon og kanylering av Cerebral Parenkymalt arterioler

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og Gene Expression Analyse av Fos-uttrykker Nerveceller fra fersk og fryst Rat hjernevev

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Avledning av leptomeninges eksplantering kulturer fra postmortem menneskelige hjerne givere

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

En rotte modell av Mild Intrauterine Hypoperfusion med Microcoil stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...