Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Queremos agradecer e reconhecer o Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson no banco de tecidos do cérebro de UK-ADC para fornecer o cérebro humano todas as amostras de tecido (número de concessão de NIH: P30 AG028383 do Instituto Nacional do envelhecimento). Agradecemos a Matt Hazzard e Tom Dolan, serviços de tecnologia da informação, tecnologia acadêmica e engajamento de professores, Universidade de Kentucky para assistência gráfica. Este projecto foi apoiado pelo 1R01NS079507 número da concessão do Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso (para B.B.) e 1R01AG039621 número de concessão do Instituto Nacional sobre o envelhecimento (para A.M.S.H).. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e derrame ou do Instituto Nacional sobre envelhecimento. Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

As informações abaixo baseia-se na atual segurança e as normas reguladoras da Universidade de Kentucky, Lexington, KY, EUA. Como uma precaução de segurança, consulte programa de segurança biológica da instituição e as mais atuais regulamentos e recomendações antes de trabalhar com tecido humano.
Atenção: O tecido humano pode ser uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue, incluindo o vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C ...

O presente protocolo descreve o isolamento dos capilares do cérebro humano intacto e viável de tecido fresco. Nesta seção, discutiremos em detalhes a seguir: 1) modificações para o protocolo 2) solução de problemas de erros comuns, 3) as limitações da técnica, 4) o significado do modelo em relação ao existente e modelos alternativos barreira hemato - encefálica, e 5). potenciais aplicações para capilares do cérebro humano isolado.
O protocolo descrito aqui é otimizado para 10...

A barreira sangue - cérebro é uma interface rigidamente controlada entre o sangue e o cérebro que determina o que entra e sai do cérebro. Anatomicamente, células endoteliais compõem a barreira sangue - cérebro e formam uma rede capilar complexa, contínua. Fisiologicamente, essa rede capilar fornece o cérebro com oxigênio e nutrientes ao simultaneamente eliminação de dióxido de carbono e produtos de resíduos metabólicos. Importante, a evidência suporta que as alterações para a barreira contribuam para inúmeras patologias, incluindo a doença de Alzheimer, epilepsia e acidente vascular cerebral1,2,3,4,5 , 6 , 7. cérebro células endoteliais também servem como uma barreira ao tratamento, bloqueando a absorção de drogas no cérebro, por exemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme seguindo tumor ressecção8,9, 10. a este respeito, os capilares do cérebro humano isolado representam um único ex vivo modelo de barreira hemato - encefálica que se assemelha a barreira propriedades in vivo, que permite o estudo da função de barreira e disfunção em saúde e a doença. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para isolar os capilares do cérebro do cérebro humano em um capilar de consistentemente de alta qualidade e rendimento para estudar a barreira sangue - cérebro.
Em 1969, Siakotos et al. 11 foram os primeiros a relatar o isolamento dos capilares do cérebro do tecido cerebral bovina e humana usando densidade gradiente centrifugação e vidro do grânulo coluna separação. Mais tarde, Goldstein et al. 12 melhorado este método adicionando várias etapas de filtração para diminuir a quantidade de tecido necessário para estudar os capilares do cérebro isolados de ratos, mantendo a atividade metabólica de transporte de glicose. Desde então, pesquisadores otimizado o procedimento de isolamento capilar inúmeras vezes, melhorar o modelo capilar método e cérebro com cada iteração13,14,15. Por exemplo, Pardridge et al. 16 isolado bovina capilares usando digestão enzimática, ao invés de homogeneização mecânica e posteriormente passou uma suspensão capilar através de um filtro de malha de 210 µm e uma coluna de vidro do grânulo. Essas modificações melhoraram a mancha de exclusão trypan azul dos capilares do cérebro isolado e assim, aumentaram a viabilidade celular endotelial. No início de 1990, Damasceno et al. 17 isolado bovina e rato capilares que eram claras de contaminação neuronal e mantida a atividade metabólica de γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) e fosfatase alcalina. Em 2000, Miller et al. 18, usado isolado de rato e capilares do cérebro suínos em combinação com microscopia confocal para mostrar o acúmulo de substratos de transporte no lúmen dos capilares. Posteriormente, nosso laboratório tem continuado a otimizar o processo de isolamento capilar do cérebro e nós estabelecemos transporte ensaios para determinar a P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, câncer de mama resistência da proteína (BCRP)22,23e proteína de resistência a múltiplas drogas 2 (Mrp2)24 atividade de transporte. Em 2004, publicou dois relatórios onde costumávamos capilares de cérebro de rato isolado para investigar diversas vias de sinalização. Em Hartz et al. 21, encontramos que o peptídeo endotelina-1 reversível e rapidamente reduzida função de transporte de P-gp em capilares cerebrais, actuando através do receptor (ETB) do receptor B de endotelina, óxido nítrico sintase (NOS) e proteína quinase C (PKC). Em Bauer et al . 19, temos demonstrado que a expressão do receptor nuclear receptor pregnane X (PXR) e mostrou PXR-modulação da função de expressão e transporte de P-gp em capilares do cérebro. Em experimentos com ratos transgénicos de PXR humanizados, nós expandidos nessa linha de pesquisa e mostrou na vivo de aperto da barreira por estrogenos P-gp através da ativação de hPXR25. Em 2010, Hartz et al. 26 usado essa abordagem para restaurar a expressão da proteína de P-gp e transportar a atividade em ratos transgénicos precursora amiloide humano proteína (hAPP) overexpress hAPP. Além disso, restaurando a P-gp no hAPP ratos reduziram significativamente níveis de cérebro de42Aβ e beta amiloide (Aβ)40.
Além de estudar a sinalização de caminhos, capilares de cérebro isolado podem ser usados para determinar as alterações na permeabilidade capilar que nos referimos como vazamento capilar. Em particular, o ensaio de fugas de Texas Red é usado para avaliar o escapamento do corante fluorescente Vermelho Texas do lúmen capilar ao longo do tempo e estes dados são usados para analisar taxas de fugas. Taxas de vazamento capilar aumentada em comparação com aqueles dos capilares de controle indicam alterações na integridade física da barreira hemato - encefálica2. Isto é valioso porque existem numerosos estados patológicos associados rompimento da barreira, por exemplo., epilepsia, esclerose múltipla, doença de Alzheimer e cerebral traumática lesão27,28,29, 30. Outros grupos também têm utilizado isolados capilares para discernir as vias de sinalização que regulam a expressão de proteínas e atividade de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Finalmente, continuamos a otimizar esse método para o isolamento dos capilares do cérebro humano e, recentemente, mostramos a expressão aumentada de P-gp no humana barreira hemato - encefálica, em pacientes com epilepsia, em comparação com indivíduos de controle livre de apreensão38 . Tomados em conjunto, estes desenvolvimentos demonstram que os capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo versátil para estudar a função de barreira.
Vários in vivo, ex vivoe em vitro barreira hemato - encefálica modelos têm sido utilizados em pesquisa básica e rastreio de drogas industriais, principalmente com o objetivo de testar a entrega da droga para o cérebro39,40,41 ,42,,43,44. Além de isolados ex vivo capilares do cérebro, modelos atuais da barreira hemato - encefálica incluem modelos em silico , em vitro cultura celular de células endoteliais capilares do cérebro isolado ou linhas de células imortalizado de vários espécie, em vitro de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) que se diferenciar em células endoteliais capilares do cérebro e microfluidic modelos em um chip.
In silico modelos são mais usados no desenvolvimento de drogas para a seleção de candidatos a fármacos com base no previsto de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) Propriedades. Métodos como modelos de relacionamento (QSPR) estrutura-Propriedade quantitativa e quantitativa estrutura-atividade relação (QSAR) são métodos populares usados na seleção da elevado-produção de bibliotecas para prever a penetração do cérebro de candidatos da droga 45 , 46. estes modelos são úteis para moléculas de tela para propriedades de penetração da barreira.
Betz et al 47 estabeleceu monocamadas de células endoteliais capilares do cérebro culta como um sistema de modelo em vitro barreira hemato - encefálica. Em vitro celular cultura modelos usando tecido fresco ou linhas de células endoteliais imortalizado como células endoteliais microvessel cerebral humana (hCMECs) podem ser outra ferramenta de seleção da elevado-produção para penetração do cérebro ou estudos mecanicistas. No entanto, modelos de cultura de células endoteliais capilares cerebrais faltam a tensão de cisalhamento fisiológico do fluxo de sangue para dentro do lúmen capilar, estão limitados a complexidade geral biológica e se submetem a mudanças na expressão e localização de componentes importante barreira como proteínas de junção apertada, íon, transportadores, enzimas e receptores de superfície canais48,,49,50. Inversamente, monocamadas endoteliais derivado hPSCs, tem permeabilidade de sacarose baixa em comparação com as culturas hCMEC/D3 e conter expressão polarizada de alguns transportadores barreira hemato - encefálica, moléculas de adesão e junções apertadas51, 52. no entanto, essas células também estão sujeitos a alteração de propriedades na cultura, e o sistema deve ser validado para sua recapitulação na vivo Propriedades barreira52.
Mais recentes tendências em pesquisa da barreira hemato - encefálica incluem utilizando sistemas de cultura de tecido 3D para criar capilares artificiais, usando a tecnologia do órgão-on-chip para gerar dispositivos microfluídicos, ou utilizando a tecnologia de fibra oca53, 54 , 55. capilares artificiais, no entanto, têm significativamente maiores diâmetros (100 – 200 µm) do que o cérebro os capilares (3 – 7 µm). Daí, o cisalhamento forças em vitro não totalmente se assemelham a situação na vivo . Esta mensagem é dirigida em dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", onde os compartimentos de "sangue" e "cérebro" de forma artificial de membranas e fluidos são bombeados através destes dispositivos, gerando forças de cizalhamento microfluidic. Da mesma forma, co culturas de células de músculo liso vascular e células endoteliais em várias combinações com astrócitos também têm sido usadas com a tecnologia de fibra oca para recriar reológicos parâmetros presentes na vivo condições56 , 57 , 58. no entanto, desconhece-se o quanto este modelo reflete outras propriedades da barreira sangue - cérebro, tais como transporte, metabolismo, sinalização e outros. Estes modelos capilar e chip artificiais são adequados para seleção da elevado-produção de drogas, mas as células usadas para gerar esses modelos também estão sujeitos a alterações durante a cultura.
Fatias de cérebro congelado e fixo ou cerebrais primários, culturas de células endoteliais capilares são modelos adicionais que podem ser usados paraestudar a microvasculatura humana5,59,60,61. Por exemplo, imuno-histoquímica do tecido cerebral fixa é usada para determinar a localização da proteína, e a expressão em saudável em relação ao tecido doente.
Além de fatias de tecido e os modelos em vitro capilares do cérebro descrito acima, recentemente isolados podem ser utilizados para estudar a função da barreira hemato - encefálica. As limitações deste modelo capilar isolada incluem a dificuldade para obter o tecido do cérebro humano fresco, ausência de astrócitos e neurônios e um processo de isolamento relativamente demorado. Uma vantagem do modelo capilar cerebral isolado é que este modelo se assemelha a situação na vivo e, portanto, pode ser usado para caracterizar a função de barreira e disfunção. Importante, ele também pode ser usado para discernir os mecanismos de sinalização usando uma infinidade de ensaios e técnicas moleculares3,19,,62,63.
Nosso laboratório tem acesso a ambos os tecidos frescos e congelados do cérebro humano através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M)64. Neste contexto, as autópsias seguem um protocolo padrão, cérebros são obtidos em < 4h e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Dado este acesso exclusivo ao tecido do cérebro humano, estabeleceu e otimizado um protocolo para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano que resulta em um alto rendimento dos capilares do cérebro humano intacto, viável. Dois pontos de extremidade comuns de interesse são para determinar a expressão da proteína e atividade. A este respeito, nós e os outros estabeleceram vários ensaios que podem ser usados com os capilares do cérebro isolado para estudar a expressão da proteína e níveis de atividade. Estes ensaios incluem mancha ocidental, ensaio de Western simples, ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), zimografia, ensaios de atividade de transporte, e ensaios de vazamento capilar. Estes ensaios permitem aos pesquisadores estudar alterações na função de barreira em condições patológicas humanas, determinar caminhos que regem a atividade e expressão da proteína e identificar alvos farmacológicos para o tratamento da barreira hemato - encefálica associada doenças.
Tomados juntos, recentemente capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo robusto e reprodutível a barreira sangue - cérebro. Especialmente, este modelo pode ser combinado com muitos ensaios diferentes para determinar uma grande variedade de pontos de extremidade para estudar a função de barreira.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Função de barreira hemato - encefálica compreensão sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que mantêm a promessa para melhorar a entrega de drogas do cérebro, melhorar a proteção do cérebro e tratar o cérebro transtornos. No entanto, estudando a função humana barreira sangue - cérebro é um desafio. Assim, há uma necessidade crítica de modelos adequados. A este respeito, os capilares do cérebro isolados do tecido do cérebro humano representam uma ferramenta única para estudar a função de barreira, como próximo a situação humana no vivo quanto possível. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar os capilares do tecido do cérebro humano em um alto rendimento e com pureza e qualidade consistente. Capilares são isolados do tecido do cérebro humano fresco usando homogeneização mecânica, gradiente de densidade centrifugação e filtração. Após o isolamento, os capilares do cérebro humano podem ser usados para várias aplicações, incluindo ensaios de vazamento, imagem de célula viva e ensaios baseados em imunológico para estudar a expressão da proteína e função, atividade enzimática ou sinalização intracelular. Cérebro humano isolado capilares são um modelo exclusivo para elucidar o Regulamento da função humana barreira hemato - encefálica. Este modelo pode fornecer insights sobre patogênese do sistema nervoso central (SNC), que irá ajudar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC.

Os isolamentos de tecido cerebral humano rendem uma suspensão enriquecida nos capilares do cérebro humano (figura 1B) com pequenas quantidades de vasos maiores, glóbulos vermelhos, outras células únicas e alguns detritos de células. Alguns capilares são ramificados, e, em alguns, os glóbulos vermelhos são aprisionados nos lúmens capilares. O capilar típico tem uma 3 – 7 µm de diâmetro e é aproximadamente 100-200 µm comprimento com lúmens abe...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Um modelo do rato de leve hipoperfusão intra-uterino com estenose Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...