Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Vi tackar och bekräftar Dr. Peter Nelson och Sonya Anderson på UK-ADC Brain vävnad Bank för att ge alla mänskliga hjärnan vävnadsprover (NIH bevilja nummer: P30 AG028383 från National Institute on Aging). Vi tackar Matt Hazzard och Tom Dolan, IT-tjänster, akademiska teknik och fakulteten engagemang, University of Kentucky för grafisk assistans. Projektet stöddes av grant nummer 1R01NS079507 från nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (till B.B.) och grant nummer 1R01AG039621 från National Institute on Aging (till A.M.S.H.). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke eller National Institute on Aging. Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Informationen nedan är baserad på nuvarande säkerhetsstandarder och andra standarder vid University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Som en säkerhetsåtgärd, se institutionens biologisk säkerhetsprogram och den mest aktuella regler och rekommendationer innan du arbetar med mänsklig vävnad.
Varning: Mänsklig vävnad kan vara en källa till blodburna patogener, inklusive humant immunbristvirus (HIV), hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV) och andra. Arbeta med mänsklig vävnad ut...

Protokolls beskriver isolering av intakt och livskraftiga mänskliga hjärnan kapillärerna från färsk vävnad. I detta avsnitt diskuterar vi i detalj följande: 1) ändringar av protokollet, 2) Felsökning av vanliga fel, 3) begränsningar av tekniken, 4) betydelsen av modellen med avseende på befintliga och alternativa blod - hjärnbarriären modeller, och 5). potentiella tillämpningar för isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna.
Protokollet beskrivs här är optimerad för 10 g fä...

På blod - hjärnbarriären är en väl kontrollerad gränssnitt mellan blod och hjärna som avgör vad går in och kommer ut ur hjärnan. Anatomiskt, endotelceller komponera på blod - hjärnbarriären och bildar ett komplex, kontinuerlig kapillär nätverk. Fysiologiskt, förser detta kapillära nätverk hjärnan med syre och näringsämnen medan samtidigt avyttra koldioxid och metabola restprodukter. Ännu viktigare, stöder bevis att barriären ändringarna bidra till många sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom, epilepsi och stroke1,2,3,4,5 , 6 , 7. hjärnan endothelial celler också fungera som ett hinder för behandling genom att blockera drog upptag in i hjärnan, t.ex., kemoterapi av glioblastoma multiforme efter tumör resektion8,9, 10. I detta hänseende isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna representerar en unik ex vivo blod - hjärnbarriären modell som liknar barriär boenden i vivo, vilket möjliggör studier av barriär-funktion och dysfunktion i hälsa och sjukdom. I denna artikel ger vi ett protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från mänskliga hjärnan på en konsekvent hög kapillär kvalitet och kapacitet för att studera på blod - hjärnbarriären.
1969, Siakotos et al. Det var först att rapportera isolering av hjärnan kapillärerna från bovin och human hjärnvävnad med täthet lutning centrifugering och glas pärla kolumn separation 11 . Senare, Goldstein et al. 12 förbättrades denna metod genom att lägga till flera filtrering steg för att minska mängden vävnad som behövs för att studera hjärnan kapillärerna isolerade från råtta, samtidigt som den metaboliska aktiviteten av glukos transporter. Sedan dess optimerad forskare kapillär isolering proceduren flera gånger, att förbättra metoden och hjärnan kapillär modellen med varje iteration13,14,15. Exempelvis Pardridge et al. 16 isolerade nötkreatur kapillärer med enzymatisk nedbrytning i stället för mekanisk homogenisering, och sedan passerade senare en kapillär suspension genom en 210 µm mesh-filter och en glas pärla kolumn. Dessa modifieringar förbättrats trypan blå utslagning fläcken av isolerade hjärnan kapillärerna, och således ökade endotelceller livskraft. I början av 1990, Dallaire et al. 17 isolerade nötkreatur och råtta kapillärer som var klara för neuronal kontaminering och underhålls metabolisk aktivitet av γ-glutamyl transpeptidasen (γ-GTase) och alkaliskt fosfatas. I 2000, Miller et al. 18, används isolerade råtta och svin hjärnan kapillärerna i kombination med konfokalmikroskopi Visa ansamling av transport substrat i lumen av kapillärer. Därpå vårt laboratorium har fortsatt att optimera hjärnans kapillära isolering förfarandet och vi har etablerat transport analyser för att fastställa P-glykoprotein (P-gp)19,20,21, bröstcancer Resistance protein (BCRP)22,23, och flera läkemedelsresistens protein 2 (Mrp2)24 transportverksamhet. I 2004 publicerat vi två rapporter där vi använt isolerade råtta hjärnan kapillärerna för att undersöka olika signalvägar. I Hartz et al. 21, vi fann att den peptid endotelin-1 snabbt och reversibelt reduceras P-gp transportfunktionen i hjärnans kapillärer genom att agera via endotelin B-receptorn (ETB) receptor, kväveoxid syntas (NOS) och proteinkinas C (PKC). I Bauer m.fl. 19, vi visade uttrycket av nukleär receptor pregnane X receptorn (PXR) och visade PXR-modulering av P-gp uttryck och transport funktion i hjärnan kapillärerna. I experiment med transgena humaniserad PXR möss, vi utökat denna linje av forskning och visade i vivo skärpning av barriären av upregulating P-gp-hPXR aktiveringen25. I 2010, Hartz et al. 26 använde denna metod att återställa P-gp proteinuttryck och transportera aktivitet hos transgena mänskliga amyloid prekursor protein (hAPP) möss som överuttrycka hAPP. Dessutom minskade återställa P-gp i hAPP möss signifikant beta-amyloid (Aβ)40och Aβ42hjärnan nivåer.
Förutom att studera signalvägar, kan isolerade hjärnan kapillärerna användas för att fastställa förändringar i kapillär permeabilitet som vi kallar kapillär läckage. I synnerhet används Texas Red läckage analysen för att bedöma läckage av den fluorescerande färgämne Texas röd från kapillär lumen över tid och dessa uppgifter används sedan för att analysera läckage. Ökad kapillär läckage jämfört med de från kontroll kapillärer indikera förändringar i den fysiska integriteten av blod - hjärnbarriären2. Detta är värdefullt eftersom det finns många sjukdomstillstånd associerade med barriär störningar, t.ex., epilepsi, multipel skleros, Alzheimers sjukdom och traumatiska hjärnan skada27,28,29, 30. Andra grupper har också använt isolerade kapillärerna att urskilja signalvägar som reglerar proteinuttryck och transportverksamhet proteiner31,32,33,34, 35,36,37. Slutligen har vi fortsatt att optimera denna metod för isolering av mänskliga hjärnan kapillärerna och, nyligen, visade vi ökat P-gp uttryck på den mänskliga blod - hjärnbarriären hos patienter med epilepsi jämfört med anfallsfria kontroll individer38 . Sammantaget visar dessa utvecklingen att isolerade hjärnan kapillärerna kan tjäna som en mångsidig modell för att studera barriärfunktion.
Olika in vivo ex vivooch in vitro- blod - hjärnbarriären modeller har använts inom grundforskning och industriella drogkontroll, främst med målet att testa narkotika leverans till hjärnan39,40,41 ,42,43,44. Förutom enstaka ex vivo hjärnan kapillärerna inkluderar nuvarande blod - hjärnbarriären modeller i silico modeller, in vitro- cellkultur för isolerade hjärnan kapillära endotelceller eller förevigade cellinjer från olika arter, i vitro kultur av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) som differentieras till hjärnans kapillära endotelceller och mikroflödessystem modeller på ett chip.
I silico modeller är vanligast i läkemedelsutveckling för att välja läkemedelskandidater baserat på förväntade absorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) egenskaper. Metoder såsom kvantitativa struktur-boendet relation (QSPR) modeller och modeller för kvantitativa struktur-aktivitetssamband (QSAR) är populära metoder används i high-throughput screening av bibliotek för att förutsäga hjärnan penetration av läkemedelskandidater 45 , 46. dessa modeller är användbara för att skärmen molekyler för penetration barriäregenskaper.
Betz o.a. 47 etablerat enskiktslager av odlade hjärnans kapillära endotelceller som en in vitro- blod - hjärnbarriären modellsystem. In vitro cell kultur modeller använder färsk vävnad eller förevigade endotelceller linjer såsom mänskliga cerebral microvessel endotelceller (hCMECs) kan vara en annan hög genomströmning screeningverktyg för hjärnan penetration eller mekanistiska studier. Men hjärnan kapillära endotelceller kultur modeller saknar fysiologiska skjuvspänningen av blodflödet inuti kapillär lumen är begränsade i övergripande biologiska komplexitet och genomgå förändringar i uttryck och lokalisering av hindret komponenter till exempel åtsittande föreningspunkt proteiner kanaler yta receptorer, transportörer, enzymer och ion48,49,50. Omvänt, endothelial enskiktslager härrör från hPSCs, har låg sackaros permeabilitet jämfört med hCMEC/D3 kulturer och innehålla polariserade uttryck av några blod - hjärnbarriären transportörer, adhesionsmolekyler och åtsittande föreningspunkter51, 52. dock dessa celler är också föremål för ändra egenskaper i kulturen, och systemet måste valideras för dess rekapitulation av i vivo barriär boenden52.
Nyare trender i blod - hjärnbarriären forskning inkluderar utnyttja 3D vävnadsodling system för att skapa konstgjorda kapillärer, använder den orgel-on-chip tekniken för att generera mikroflödessystem enheter, eller utnyttja den ihålig fiber teknik53, 54 , 55. konstgjorda kapillärerna, men har betydligt större diametrar (100 – 200 µm) än hjärnan kapillärerna (3 – 7 µm). Därför liknar den skjuvning styrkor in vitro- inte helt i vivo situationen. Detta behandlas i ”blood-brain-barrier-on-a-chip” mikrofabricerade enheter, där konstgjorda membran form ”blod” och ”hjärnan” fack och vätskor pumpas genom dessa enheter generera mikroflödessystem skeva styrkor. Likaså har samtidig kulturer av endothelial celler i olika kombinationer med astrocyter och vaskulära glatta muskelceller också använts med ihålig fibertekniken för att återskapa reologiska parametrar närvarande enligt in-vivo -villkor-56 , 57 , 58. det är dock oklart hur väl denna modell återspeglar andra egenskaper för den blood - brain barriären såsom transport, metabolism, signalering och andra. Dessa konstgjorda kapillär och chip modeller är lämpliga för high-throughput screening av droger, men de celler som används för att generera dessa modeller kan också ändras under kultur.
Frysta och fast hjärnan skivor eller primära hjärnans kapillära endotelceller kulturer finns ytterligare modeller som kan användas för attstudera den mänskliga mikrocirkulation5,59,60,61. Till exempel immunohistokemi fast hjärnan vävnad används för att bestämma protein lokalisering och uttryck hos friska jämfört med sjuk vävnad.
Beskrivs ovan, nymalen isolerade hjärnan kapillärerna kan utnyttjas för att studera blod - hjärnbarriären funktion förutom vävnad skivor och in vitro- modeller. Begränsningar av denna isolerade kapillär modell är svårigheten att få färska mänsklig hjärnvävnad, avsaknad av astrocyter och nervceller, och en relativt tidskrävande isolering process. En fördel med isolerade hjärnan kapillär modellen är att denna modell liknar i vivo situationen och därför kan användas för att karaktärisera barriärfunktionen och dysfunktion. Ännu viktigare, kan det också användas att urskilja signalering mekanismer med hjälp av en mängd analyser och molekylärbiologiska metoder3,19,62,63.
Vårt laboratorium har tillgång till både färsk och fryst mänsklig hjärnvävnad genom Sanders-brun centrum på åldrande (IRB nr B15-2602-M)64. I detta sammanhang obduktioner följer ett standardprotokoll, hjärnor erhålls i < 4 h, och alla förfaranden överensstämmer med NIH Biospecimen riktlinjer för bästa praxis65. Få detta unika tillgång till mänsklig hjärnvävnad, vi etablerade och optimerad ett protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad som resulterar i en hög avkastning av intakt, livskraftiga mänskliga hjärnan kapillärerna. Två gemensamma slutpunkter av intresse är att bestämma proteinuttryck och aktivitet. I detta sammanhang har vi och andra etablerat olika analyser som kan användas med isolerade hjärnan kapillärerna för att studera proteinuttryck och aktivitetsnivåer. Dessa analyser omfatta Western blotting, enkel Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR), kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR), zymography, transport aktivitet analyser, och Kapillär läckage analyser. Dessa analyser tillåter forskare att studera förändringar i barriärfunktion i mänskliga patologiska förhållanden, bestämma vägar som reglerar proteinuttryck och aktivitet och identifiera farmakologiska mål för behandling av blod - hjärnbarriären är associerad sjukdomar.
Tas tillsammans, nymalen isolerade hjärnan kapillärerna kan fungera som en robust och reproducerbart modell av den blod - hjärnbarriären. Särskilt, kan denna modell kombineras med många olika analyser för att fastställa en rad olika slutpunkter att studera barriärfunktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Personal Protective Equipment (PPE)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>32916-636</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Protective Labcoats</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>470146-214</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield, disposable</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>19460102</td>
			<td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>01-815-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versi Dry Bench Paper 18&#34; x 20&#34;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>14-206-32</td>
			<td>to cover working areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Sharps Container Systems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75800-272</td>
			<td>for used scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz</td>
			<td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td>
			<td>323775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C Refrigerator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>13-986-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>AB15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidolph RZR 2102 Control</td>
			<td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td>
			<td>501-21024-01-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica L2 Dissecting Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td>
			<td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td>
			<td>9158168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale P-403</td>
			<td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td>
			<td>0191392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard mini Stir</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>1151050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td>
			<td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td>
			<td>11-670-4C</td>
			<td>used to freeze the tissue?</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voyager Pro Analytical Balance</td>
			<td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td>
			<td>VP214CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axiovert Microcope</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to check isolated capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 1-5mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377823T1</td>
			<td>wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette II Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21377821T1</td>
			<td>resuspend pellet in BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Boy</td>
			<td>Integra, Hudson, NH, USA</td>
			<td>739658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EISCO Scalpel Blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>S95938C</td>
			<td>to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>to cover beaker and volumetric flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>21-377-304</td>
			<td>to wash capillaries off filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 ml syringe with Luer-Lok</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td>
			<td>BD309653</td>
			<td>used with connector ring to filter capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>10060-13</td>
			<td>used for mincing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>3431E25</td>
			<td>50 ml volume, clearance: 150-230 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogenizer</td>
			<td>VWR, Radnor PA USA</td>
			<td>62400-642</td>
			<td>15 ml volume, clearance: 80-130 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &#181;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td>
			<td>146424</td>
			<td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainers (pore size: 30 &#181;m)</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector Ring</td>
			<td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td>
			<td>41-50000-03</td>
			<td>reuse multiple time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Volumetric Flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 l Beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Bottle (60 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for preparation of Ficoll&#174;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep everything cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mincing of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Cell Scraper</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89260-222</td>
			<td>to remove supernatant after centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Fraction V, A-9647</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647-500g</td>
			<td>prepare in DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Ca2+ &#38; Mg2+</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30264.FS</td>
			<td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll PM400</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>F4375</td>
			<td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>71474</td>
			<td>to adjust pH of the DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Concentration: 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Förståelse blod - hjärnbarriären funktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden är avgörande för utvecklingen av nya terapeutiska strategier som håller löftet att förbättra hjärnan drug delivery, förbättra hjärnans skydd och behandla hjärnan störningar. Dock är att studera funktionen människors blod - hjärnbarriären utmanande. Således finns det en kritisk behovet av lämpliga modeller. I detta avseende representerar hjärnans kapillärer isolerade från mänsklig hjärnvävnad ett unikt verktyg för att studera barriärfunktion som nära mänskliga i vivo situationen som möjligt. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för att isolera kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad på en hög avkastning och med jämn kvalitet och renhet. Kapillärerna är isolerade från färska mänsklig hjärnvävnad med mekaniska homogenisering, täthetlutning centrifugering och filtrering. Efter isoleringen, kan mänskliga hjärnan kapillärerna användas för olika tillämpningar, inklusive läckage analyser, levande cell imaging och immun-baserade analyser för att studera proteinuttryck och funktion, enzymaktivitet eller Intracellulär signalering. Isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna är en unik modell för att belysa reglering av funktionen människors blod - hjärnbarriären. Denna modell kan ge insikter i centrala nervsystemet (CNS) patogenes, vilket kommer att bidra till utvecklingen av terapeutiska strategier för behandling av CNS-sjukdomar.

Isoleringar från mänsklig hjärnvävnad ger en suspension berikad i mänskliga hjärnan kapillärerna (figur 1B) med små mängder av större fartyg, röda blodkroppar, andra enstaka celler och vissa cellfragment. Vissa kapillärer är Grenade, och, i vissa röda blodkroppar är anhållna i de kapillär lumina. Den typiska kapillären har en 3 – 7 µm diameter och är ca 100-200 µm lång med öppet lumen. de flesta kapillär ändarna döljs. Isolerade m?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Isolerade hjärnan kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad kan användas som en preklinisk modell för att studera barriärfunktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dubbel Fluorescens På plats Hybridisering i Fresh Brain § §

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder för studier av Neuronal Morfogenes:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryonal Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk Implantation för kronisk optogenetic Stimulering av hjärnvävnad

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Isolering av cerebrospinalvätska från Gnagare Embryon för användning med Dissekerade cerebrala kortikala Explantat

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Isolering och kanylering av cerebral parenkymal arterioler

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och Gene Expression Analys av Fos-uttryckande nervceller från färsk och fryst Rat hjärnvävnad

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Härledning av Leptomeninges Explantation kulturer från obduktions Human Brain Donatorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

En råtta modell av Mild intrauterin Hypoperfusion med Microcoil stenos

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...