Name: co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00
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Agradecemos os membros do laboratório de discussões úteis e comentários Wang. Este trabalho é apoiado pela Nacional Natural Science Foundation da China (NSFC, grant, n. º 31570001) e a Fundação ciência Natural da província de Guangdong e cidade de Guangzhou (conceder 201707010024 e n. º 2016A030313401) para H.W.

1. primer Design estratégia e amplificação de DNA
<ol><li>Desenha os primers para clonagem molecular de fragmentos de DNA. Os primers compõem 20 sequências de ligação específica do gene de bp e 20 a 25 bp-extremidade 5' saliência sequências, que são a sequência complementar sobreposição de moléculas de DNA adjacentes (ver tabela 1 , por exemplo). Nota: A montagem posterior de cada DNA fragmentos, enlace de cassettes de expressão de diferentes proteínas, e integração com o vetor de...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+machinery+of+live+cells.">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way.">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li><li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology.">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells.">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li><li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall.">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation.">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li><li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Expression+Systems+in+Plants:+Potentialities+and+Constraints.">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li><li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize.">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246 (2017).</li><li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method:+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies.">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li><li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization,+movement+and+interactions+in+planta.">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li><li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells.">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li><li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes.">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li><li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions.">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression,+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants.">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li><li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+red+fluorescent+protein+eqFP611:+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants.">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+sorting+receptors+(VSRs)+and+secretory+carrier+membrane+proteins+(SCAMPs)+are+essential+for+pollen+tube+growth.">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li><li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+sorting+receptor+(VSR)+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes.">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li><li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR.">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li><li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination.">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li><li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly.">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li><li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha.">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells.">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li><li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated,+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells.">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li><li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells:+evidence+for+two+pathways.">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li><li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression,+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus,+Aspergillus+nidulans.">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li><li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+gene+silencing+regularized.">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li><li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants.">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li><li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing.">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li><li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+for+all:+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants.">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).</li><li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops.">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li><li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+&amp;#34;purple+endosperm+rice''+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system.">Development of &amp;#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li><li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+formation,+evolution,+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes.">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li></ol>

Aqui temos demonstrado um método novo expressar robustamente co proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele pode ser usado tanto para expressão transiente e transformação genética e é compatível com o atual fluorescentes à base de proteínas de bio-imagem, moleculares e bioquímicos aplicativos e tecnologias9,10,13 . Além disso, ele supera as dificuldades dos métodos convencionais que usam vários plasm?...

Proteínas quiméricas fluorescente fusão tem sido consideradas como ferramentas úteis para estudar a dinâmica intracelular e Localização subcellular e entender melhor suas funções fisiológicas e trabalho mecanismos1,2, 3 , 4. é especialmente benéfico para as proteínas de repórter de organela conhecido co express com a proteína em questão para ilustrar melhor sua lógica spatiotemporal, distribuição e funções dentro do sistema endomembranoso em células4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Uma proteína de fusão fluorescente quimérico pode ser expressa em plantas através de expressão transiente e transformação genética estável, que têm suas respectivas vantagens e limitações9,10,11. Expressão transitória de uma proteína é uma abordagem conveniente que inclui biobalística bombardeamento-, polietileno glicol (PEG)-, ou mediada por eletroporação DNA expressão transiente em protoplastas e Agrobacterium-mediada por infiltração de folha em células de vegetais intactos, como mostrado na figura 1A, B12,13,14,15,16. No entanto, a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em uma célula única planta requer uma mistura de vários plasmídeos de expressão independente. Assim, as desvantagens da contratação de múltiplos plasmídeos co na expressão de proteínas em plantas são baixos níveis de expressão co devido a drasticamente reduzida chance de vários plasmídeos entrar simultaneamente as mesmas células quando comparado a um único plasmídeo e o variações dos níveis de expressão de proteínas causadas pela quantidade incontrolavelmente aleatória de cada tipos de plasmídeo sendo transferido para a célula17,18. Além disso, é tecnicamente desafiador para introduzir vários plasmídeos de expressão independente em um único Agrobacterium para proteína expressão co9,10,11. Portanto, Agrobacterium-mediada por proteínas expressão transiente por infiltração de tabaco em folhas só é capaz de expressar um plasmídeo ao mesmo tempo, como mostrado na figura 1B. Em contraste, geração de plantas transgênicas expressando proteínas da fusão fluorescente geralmente é conseguida por Agrobacterium que carrega um vetor de transformação binário. No entanto, o vetor binário que medeia a transferência de genes e inserção em genomas a planta só é capaz de expressar uma fusão única de fluorescente proteína (figura 1B)9,10,12. Gerando uma planta transgênica que expressa várias proteínas fluorescentes quiméricoes simultaneamente requer várias rodadas de cruzamento genético e triagem, que pode levar de meses a anos, dependendo do número de genes para ser co expressa.
O emprego de que um vetor de expressão única expressão co de múltiplas proteínas na planta tem sido relatado por vários anteriores estudos19,20,21. No entanto, várias rodadas de digestão enzimática e ligadura do DNA de moléculas de DNA e vetores de espinha dorsal são geralmente necessárias para geração do plasmídeo final para expressão de proteínas co ou sobre-expressão. Aqui, nós desenvolvemos um método novo e robusto para expressar co várias proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. É um método altamente eficiente e conveniente que atinge vários expressão co de proteínas em plantas para tanto expressão transiente e transformação estável de forma honrada. Ele emprega um vetor único que contém várias fitas de expressão de proteínas funcionalmente independente co na expressão de proteínas e, assim, supera os inconvenientes dos métodos convencionais. Além disso, é um sistema altamente versátil, no qual DNA manipulações e montagem são atingidos por uma reação de uma etapa simples otimizada sem etapas extras de digestão do DNA e da ligadura. O princípio de funcionamento está ilustrado na Figura 2. Além disso, é totalmente compatível com abordagens atuais de celulares, moleculares e bioquímicas que são baseadas em proteínas da fusão fluorescente quimérico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KOD-FX Polymerase</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sma I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0141L/S/V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A600194-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A601336-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#N0447V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>BBI</td>
			<td>C4H10O2S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A100159-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A600641-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>T5E4111K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A500737-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A600560-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A614270-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold microcarrier particles</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2263</td>
			<td>1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>BBI</td>
			<td>CD0050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrocarriers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rupture disk</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopping screen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A610476-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A610440-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A600219-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>Genview</td>
			<td>AH169-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0975-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A600163-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352H-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSD-1000/He particle delivery system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 7 DUO (780&#38;7Live)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPS-300 Power Supply</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>EPS 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A600234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>BBI</td>
			<td>A100339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetie Acid</td>
			<td>BBI</td>
			<td>B300599</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants

Informações sobre a spatiotemporal localization(s) subcelular de uma proteína são fundamentais para entender suas funções fisiológicas nas células. Proteínas fluorescentes e geração de proteínas fluorescentes fusão tem sido usados descontroladamente como ferramenta eficaz Visualizar diretamente a localização da proteína e a dinâmica nas células. É especialmente útil para compará-los com marcadores de organela conhecido depois da expressão co com a proteína de interesse. No entanto, abordagens clássicas co na expressão de proteínas em plantas geralmente envolvem múltiplos plasmídeos de expressão independente e portanto tem inconvenientes que incluem eficiência baixa expressão co e variação do nível de expressão do que na hora despesas em cruzamento genético e triagem. Neste estudo, descrevemos um método robusto e inovador para expressão co de múltiplas proteínas fluorescentes quiméricoes em plantas. Ele supera as limitações dos métodos convencionais usando um vetor de expressão única que é composto de várias fitas expressando semi-independentes. Cada gaveta de expressão da proteína contém seus próprios elementos de expressão de proteínas funcionais, e, portanto, pode ser ajustado com flexibilidade para atender à demanda diversificada de expressão. Além disso, é fácil e conveniente para realizar a montagem e manipulação de DNA fragmentos no plasmídeo de expressão por meio de uma reação de uma etapa otimizado sem digestão adicional e passos de ligadura. Além disso, é totalmente compatível com tecnologias atuais de bio-imagem fluorescente proteínas derivadas e aplicações, tais como o traste e BiFC. Como uma validação do método, utilizamos este novo sistema receptor de classificação vacuolar express co fluorescente fundido e proteínas de membrana transportadora secretoras. Os resultados mostram que suas localizações subcellular perspectiva são os mesmos como em estudos anteriores pela expressão transiente e transformação genética em plantas.

Nós desenvolvemos um método robusto e altamente eficiente para a expressão co de múltiplas proteínas quiméricas fusão fluorescente em plantas. Ele rompe as barreiras do convencional abordagens usam múltiplos plasmídeos separados co na expressão de proteínas, como mostrado na figura 1A, B, através de expressão transiente ou transformação genética estável. Neste novo método, geramos um vetor de expressão única que ?...

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Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Química

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Preparação fácil e eficiente de glicopolímeros fluorescentes Tri-componente via polimerização controlada pelo JANGADA

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

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