Name: construction of synthetic phage displayed fab library with tailored diversity
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity at JoVE.com

המחברים מעריך ד ר פרדריק Fellouse מן המעבדה Sidhu עבור תגובות ביקורתיות של Kunkel שיטה מבוססת phage Fab סינתטי ספריית הבנייה. המחברים מעריך את גברת משה סגל Pavlenco וחברים אחרים מן המעבדה Sidhu לעזרה יקר של הכנת יעילות גבוהה אלקטרו-המוסמכת תאים e. coli , באיכות גבוהה דו-ssDNA. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (מענק מס: 81572698, 31771006) DW, על ידי אוניברסיטת ShanghaiTech (מענק מס: F-0301 בשידור-13-005) כדי מעבדה של נוגדן הנדסה.

הערה: מסנן סטרילי טיפים יש להשתמש בכל רחבי בהתמודדות עם phage כדי למנוע הדבקות פיפטה האקדח וסביבתה. באזור aseptic או הוד חייב לשמש בעת טיפול עם חיידקים, phage ניסויים. אזור ניסוי phage יש לנקות באמצעות 2% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) ואחריו אתנול 70% כדי למנוע זיהום phage. עבור ביצוע דילולים טורי פרוטוקול זה, עצ...

<ol>
	<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies:+A+Review.">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li><li>Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+watch+in+2017.">Antibodies to watch in 2017.</a> MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybridoma+revolution:+an+offshoot+of+basic+research.">The hybridoma revolution: an offshoot of basic research.</a> Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).</li><li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-Friendly+Affinity+Reagents:+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack.">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li><li>Hutchison, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence.">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li><li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).</li><li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning.">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li><li>Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+human+antibodies+in+clinical+development+and+therapy.">Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy.</a> MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).</li><li>Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+therapeutic+antibodies.">Synthetic therapeutic antibodies.</a> Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).</li><li>Adams, J. J., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antibody+technologies.">Synthetic antibody technologies.</a> Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+for+selection+of+novel+binding+peptides.">Phage display for selection of novel binding peptides.</a> Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).</li><li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies.">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).</li><li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT+unique+numbering+for+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+variable+domains+and+Ig+superfamily+V-like+domains.">IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.</a> Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).</li><li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+between+Peptostreptococcus+magnus+protein+L+and+a+human+antibody+reveals+structural+convergence+in+the+interaction+modes+of+Fab+binding+proteins.">Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins.</a> Structure. 9 (8), 679-687 (2001).</li><li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody:+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity.">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li><li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries.">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li><li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display.">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li><li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+antibody+molecule.">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).</li><li>Fantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody+library+diversity+through+next+generation+sequencing+and+technical+error+compensation.">Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation.</a> PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).</li><li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+in+library+selection+projects:+what+insight+does+it+bring?.">Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?.</a> Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).</li><li>Perelson, A. S., Oster, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+studies+of+clonal+selection:+minimal+antibody+repertoire+size+and+reliability+of+self-non-self+discrimination.">Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination.</a> J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).</li><li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries.">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492 (2015).</li><li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity,+developability+and+functional+size:+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation.">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li><li>Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+therapeutics+-+the+evolving+patent+landscape.">Antibody therapeutics - the evolving patent landscape.</a> N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).</li></ol>

כדי לבנות גיוון גבוהה, המוצג phage ספריות Fab, בקרת איכות נקודות ביקורת יש צורך לעקוב אחר השלבים השונים של תהליך הבנייה, לרבות את כשירות של תאים אלקטרו-מוסמך, איכות של תבנית דו-ssDNA, היעילות של CCC-dsDNA סינתזה, כייל נוגדנים לאחר אלקטרופורציה קיפול Fab, חומצת אמינו המגוון של Cdr על ידי ניתוח רצף של Fab-phage ש...

mAbs יש שימושים רחב החל מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי. נכון לשנת 2016, mAbs יותר מ- 60 אושרו על ידי ארצות הברית המזון סמים המינהל (USFDA) לטיפול קלינית של מחלות אוטואימוניות, סרטן, מחלות זיהומיות1,2.
בשנת 1975, קולר, מילשטיין דיווח טכניקה לדור רציפה של נוגדנים היחודיות המשובטים יחיד ממקור הסלולר המכונה 'hybridomas', טכניקה זו לאחר מכן הפכה לאבן פינה ברפואה ובתעשייה3 ,4. דור של mAbs בשיטה זו דורש צעדים שונים כולל ייצור אנטיגן, חיסון עכבר, מיצוי של B לימפוציטים, פיוז'ן של תאי B עם תאי מיאלומה כדי ליצור תאים ליפידים בן אלמוות, שיבוט בחירה, ליישומים טיפוליים, האנשה נדרש להימנע אנטי-העכבר אנושית נוגדנים (חמה)4,5. עם זאת, לטכנולוגיה הזו, אנטיגנים כולל רעלנים, פתוגנים של חלבונים גבוהה שנשמרת אינם יעילים יחסית מפעילה ויוו תגובה חיסונית mAb הפקה5.
בשנת 1978, האצ'יסון. et al. דיווח על השימוש oligonucleotide ישירה מוטגנזה מכוונת של משקע וירוס חד גדילי bacteriophage6. בשנת 1985, סמית דיווחו שברי גנים זרים יכולים להיות התמזגו במסגרת עם הגן קידוד phage המעיל החלבון השלישי ובכך ניתן להציג על פני phage מבלי להתפשר על שלה infectivity7. אלה חלוצי עבודות הניח בסיס לבנייה עוקבות של נוגדן המוצג phage בספריות תמים החיסון, וטפסים סינתטיים עם התבניות של המקטע משתנה יחיד-שרשרת (scFv) וגם אנטיגן מחייב פרגמנט (Fab) עבור טיפולית mAb פיתוח8,9. מ מנקודת מבט טכנית, פיתוח נוגדן מבוסס התצוגה phage מציעה גישה המשלימה לפיתוח מבוסס-ליפידים mAb שיכול לעזור לעקוף את המגבלות שאנטיגנים מסוימים יכול להוות, האנשה לעבד את זה ליפידים-derived נוגדנים לעיתים קרובות דורשים5. החל 2016, mAbs, נגזר תצוגה ל- 6 phage אושרו במשק לרבות Humira, לאחד mAbs המצליח ביותר משמש לטיפול בדלקת מפרקים שגרונית, מועמדים רבים של נוגדן נגזר התצוגה phage הינם כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים החקירה10.
לספריות החיסון ותמימה phage נוגדן, המגוון של משלימים את החסר-קביעת אזורים (Cdr) בשרשרת קל וכבד נגזר מן הרפרטואר החיסון הטבעי (כלומר, מתאי B). לעומת זאת, המגוון של Cdr בספריות נוגדן phage סינתטית היא מלאכותית לחלוטין. גישות סינתטי בניית הספרייה לספק שליטה מדויקת על העיצוב של רצף גיוון להציע הזדמנויות ללימודים מכניסטית של נוגדן מבנה, לתפקד11,12. יתר על כן, ניתן למטב את המסגרת עבור ספריות סינתטי לפני הבנייה הספריה כדי להקל על במורד הזרם, בפיתוח תעשייתי רחב היקף11,12.
בשנת 1985, Kunkel דיווח בגישה מוטגנזה מכוונת המבוססים על תבנית חד גדילי הדנ א (ssDNA) כדי להציג את האתר מכוון מוטציות לתוך M13 bacteriophage ביעילות13. גישה זו היה שימוש נרחב לאחר מכן להקמת ספריות phage המוצג. Oligonucleotides DNA מסונתז כימית שנועד להציג את המגוון לתוך Fab Cdr משולבים של phagemid עם תבנית עמוד השדרה של נוגדן. בתהליך זה, phagemid מבוטאת ssDNA המכילים אורציל (דו-ssDNA), oligonucleotides הם annealed אל Cdr והרחבה לסנתז DNA גדילי כפול (dsDNA) בנוכחות T7 DNA פולימראז ו T4 DNA ליגאז. לבסוף, ds-DNA שנוצר יכול להיות מוחדרים Escherichia coli מאת אלקטרופורציה.
גיוון גבוהה, ספריית המוצג phage הבנייה, מתח גבוה אלקטרופורציה תערובת שני תאים אלקטרו-מוסמך, covalently dsDNA עגול סגור (CCC-dsDNA) צריך להיות מוכן בקפידה. . Sidhu et al. ששינה את הכנת תאים אלקטרו-המוסמכת ודנ א שיטות מסורתיות, ספריה משופרת באופן משמעותי גיוון14.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבנייה של ספריות Fab המוצג phage סינתטי עם הבדלים של 109-1010 השגה עם אלקטרופורציה יחיד. איור 1 מציג סקירה של ספריית הבנייה כולל: 1) הכנה תא אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה; 2) הפקת דו-ssDNA; 3) השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת; 4) אלקטרופורציה, חישוב של גודל הספרייה; 5) חלבון A/L-מבוסס אליסה לקיפול והערכה פונקציונלי; ו- 6) ניתוח רצף הדנ א של גיוון. כל ריאגנטים, זנים, ציוד מפורטים בטבלה של החומר. טבלה 1 מציגה את הכיוונון מגיב.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M H3PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC29570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18330-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM dithiothreitol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM dNTP mix</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-4065-60</td>
			<td>solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;,5,5&#8217;-tetramethylbenzidine (TMB)</td>
			<td>Kirkegaard &#38; Perry Laboratories Inc</td>
			<td>50-76-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, carb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1389</td>
			<td>100 mg/mL in water,&#160; 0.22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 100 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, cmp</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>100 mg/mL in ethanol, 0.22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9620G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J637-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 peroxidase substrate</td>
			<td>Kirkegaard &#38; Perry Laboratories Inc</td>
			<td>50-65-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, kan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC61129</td>
			<td>50 mg/mL in water,&#160; 0.22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 50 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>U19C015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS256</td>
			<td>! CAUTION NaOH causes burns.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NON-Fat Powdered Milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-HRP conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>101123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>22704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>77679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0274S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, tet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td>50 mg/mL in water, 0. 22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0123-07-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DF0127-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli CJ236</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E4141</td>
			<td>Genotype: dut-&#160; ung-&#160; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F&#39; camr). Used for preparation of dU-ssDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli SS320</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60512</td>
			<td>Genotype: [F&#39;proAB+lacIq lacZ&#916;M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &#916;(araABC-leu)7679 &#916;lacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-cm gap electroporation cuvette</td>
			<td>BTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 2mL Deep-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>278743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Maxisorp immunoplates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>151759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-630 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed shaker</td>
			<td>TAITEK</td>
			<td>MBR-034P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handler for 96 and 384 wells</td>
			<td>RAININ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutil-channel pipette</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>E4XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC803096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of synthetic phage displayed fab library with tailored diversity

הביקוש נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) מחקר בסיסי ורפואה הולך וגדל מדי שנה. ליפידים הטכנולוגיה כבר השיטה הדומיננטית לפיתוח mAb מאז את הדו ח הראשון שלה בשנת 1975. כמו טכנולוגיה חלופית, שיטות תצוגה phage לפיתוח mAb הן יותר ויותר אטרקטיבי מאז Humira, הנוגדן הראשון נגזר phage ואחד mAbs הנמכר, אושרה לטיפול קליני של דלקת מפרקים שגרונית בשנת 2002. חיה-שאינו מבוסס טכנולוגיית פיתוח mAb, התצוגה phage עוקף אנטיגן immunogenicity, האנשה ותחזוקה בעלי חיים הדרושים של ליפידים מסורתי המבוסס על טכנולוגיית פיתוח נוגדן. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבנייה של ספריות Fab המוצג phage סינתטי עם הבדלים של 109-1010 השגה עם אלקטרופורציה יחיד. פרוטוקול זה מורכב: 1) הכנה תא אלקטרו-המוסמכת יעילות גבוהה; 2) הפקת המכילות אורציל דנ א חד גדילי (דו-ssDNA); 3) השיטה של Kunkel המבוסס על oligonucleotide מכוון מוטגנזה מכוונת; 4) אלקטרופורציה, חישוב של גודל הספרייה; 5) חלבון מבוססת על A/L מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) לקיפול והערכה פונקציונלי; ו- 6) ניתוח רצף הדנ א של גיוון.

בעקבות את תרשים זרימה הקמת ספריה ללונג (ראה איור 1), הכנו המסייע M13KO7 תאים אלקטרו-המוסמכת של e. coli SS320 phage מראש נגוע. היעילות של תאים אלקטרו-המוסמכת אלה מוערך כמו 2 X 109 cfu/µg כאשר עמוד השדרה Fab phagemid לבנייה הספרייה שימשה (איור 4).
<p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity at JoVE.com

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט להקמת ספרייה המוצג phage נוגדן סינתטי עם גיוון מחויטת. נוגדנים סינתטי יש יישומים רבים של מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי.

בניית Phage סינתטי מוצגת ספריית Fab עם גיוון המותאמים

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...