Name: construction of synthetic phage displayed fab library with tailored diversity
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity at JoVE.com

Авторы признательны д-р Фредерик Fellouse из Сидху лаборатории для критических замечаний Канкел в метод основан синтетических Fab Фаговые библиотека строительство. Авторы ценят миссис Алевтина Павленко и других членов из лаборатории Сидху за ценную помощь подготовки высокой эффективности электро компетентных клеток кишечной палочки и высокое качество dU-ssDNA. Эта работа была поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (Грант №: 81572698, 31771006) для DW и ShanghaiTech университета (Грант №: F-0301-13-005) в лаборатории инженерной антител.

Примечание: Стерильные советы фильтр должен использоваться во всем при работе с Фаговые чтобы избежать загрязнения пипеткой пистолет и окрестностях. Асептические области или капот должны использоваться при обработке с бактериями и ФАГ экспериментов. Фаговые эксперимент области долж...

<ol>
	<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies:+A+Review.">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li><li>Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+watch+in+2017.">Antibodies to watch in 2017.</a> MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybridoma+revolution:+an+offshoot+of+basic+research.">The hybridoma revolution: an offshoot of basic research.</a> Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).</li><li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-Friendly+Affinity+Reagents:+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack.">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li><li>Hutchison, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence.">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li><li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).</li><li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning.">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li><li>Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display-derived+human+antibodies+in+clinical+development+and+therapy.">Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy.</a> MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).</li><li>Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+therapeutic+antibodies.">Synthetic therapeutic antibodies.</a> Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).</li><li>Adams, J. J., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antibody+technologies.">Synthetic antibody technologies.</a> Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+for+selection+of+novel+binding+peptides.">Phage display for selection of novel binding peptides.</a> Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).</li><li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies.">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).</li><li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT+unique+numbering+for+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+variable+domains+and+Ig+superfamily+V-like+domains.">IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.</a> Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).</li><li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+between+Peptostreptococcus+magnus+protein+L+and+a+human+antibody+reveals+structural+convergence+in+the+interaction+modes+of+Fab+binding+proteins.">Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins.</a> Structure. 9 (8), 679-687 (2001).</li><li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody:+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity.">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li><li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries.">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li><li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display.">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li><li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+antibody+molecule.">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).</li><li>Fantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody+library+diversity+through+next+generation+sequencing+and+technical+error+compensation.">Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation.</a> PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).</li><li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+in+library+selection+projects:+what+insight+does+it+bring?.">Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?.</a> Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).</li><li>Perelson, A. S., Oster, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+studies+of+clonal+selection:+minimal+antibody+repertoire+size+and+reliability+of+self-non-self+discrimination.">Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination.</a> J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).</li><li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries.">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492 (2015).</li><li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity,+developability+and+functional+size:+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation.">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li><li>Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+therapeutics+-+the+evolving+patent+landscape.">Antibody therapeutics - the evolving patent landscape.</a> N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).</li></ol>

Чтобы построить высокое разнообразие, фаг отображается Fab библиотек, контроль качества контрольно-пропускные пункты необходимы для мониторинга различных этапов процесса строительства, включая компетентность электро компетентных клеток, качество dU-ssDNA шаблона, эффективность СТС dsDNA с...

mAbs имеют широкое применение, начиная от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии. Начиная с 2016 года более чем 60 mAbs были одобрены Соединенных Штатов продовольственной и наркотиков администрации (АППМ) для клинического лечения аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных заболеваний в1,2.
В 1975 году Колер и Мильштейн сообщили, что техника для непрерывного поколения антител одного клоновых специфичности от клеточного источника называют «hybridomas» и этот метод впоследствии стать краеугольным камнем в медицине и промышленности3 ,4. Поколение mAbs этот метод требует различные шаги, в том числе производство антигена, мыши иммунизации, извлечения лимфоцитов B, слияния клеток B с миеломой клетки сформировать Бессмертный hybridoma клетки, клон выбор и для терапевтического применения, Гуманизация требуется избежать человеческих антител анти мыши (HAMA)4,5. Однако для этой технологии, антигены, включая токсины, патогенов и высоко сохраненных белков являются относительно неэффективными в провоцировании в vivo иммунный ответ для mAb производства5.
В 1978 году Хатчинсон et al. сообщили об использовании олигонуклеотида для прямого мутагенеза остатков в одноцепочечной бактериофага вирус6. В 1985 году Смит сообщила, что иностранные гена фрагменты могут сливается в рамке с гене шифруя протеин пальто Фаговые III и таким образом могут быть отображены на поверхности Фаговые без ущерба для его инфективности7. Эти новаторские работы заложили фундамент для последующего строительства библиотек ФАГ отображается антител в иммунной, наивно, и синтетические формы с форматами переменной фрагмент одной цепи (scFv) и антиген связывая фрагмент (ФАБ) для терапевтических МАБ развития8,9. С технической точки зрения ФАГ дисплей на основе антител развития предлагает дополнительный подход к развитию на основе гибридомной МАБ, которые могут помочь обойти ограничения, которые могут представлять некоторые антигены и гуманизации процесса гибридомной полученные антител часто требуют5. По состоянию на 2016 6 Фаговые дисплей производные mAbs были одобрены на рынке, включая Humira, один из самых успешных mAbs, используется для лечения ревматоидного артрита, и многие кандидаты Фаговые отображения полученных антител в настоящее время находятся на различных стадиях клинических расследование10.
Для иммунной и наивно Фаговые антитела библиотек, разнообразие взаимодополняемости определение регионов (CDR) в легких и тяжелых цепи является производным от природных иммунной репертуар (т.е., от клетки B). В противоположность этому разнообразие CDR-файлов в библиотеках антитела синтетических Фаговые полностью искусственный. Синтетические подходы к построению библиотеки обеспечивают точный контроль над дизайн последовательности разнообразия и предлагают возможности для механистический исследования структуры антител и функционировать11,12. Кроме того рамки для синтетических библиотек может быть оптимизирована до строительства библиотеки для облегчения вниз по течению, крупномасштабного промышленного развития11,12.
В 1985 году, Канкел сообщили одноцепочечной ДНК (ssDNA) на основе шаблона мутагенеза подход эффективно представить сайт направленных мутаций в бактериофага M1313. Этот подход был впоследствии широко используется для строительства ФАГ отображается библиотек. Химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК предназначена внести разнообразие в Fab CDR включены в phagemid с шаблоном позвоночника антитела. В этом процессе phagemid выражается в урацил содержащих ssDNA (дю ssDNA) и олигонуклеотиды отожженная на CDR и продлил синтезировать двуцепочечной ДНК (dsDNA) в присутствии Т7 ДНК-полимеразы и T4 ДНК лигаза. Наконец сгенерированный ds ДНК может быть введено в Escherichia coli электропорации.
Высокое разнообразие, фаг отображается библиотека строительство, электропорация высоковольтные двухкомпонентная смесь электро компетентных клеток и ковалентно закрытой круговой dsDNA (CCC-dsDNA) должен быть подготовлен тщательно. Сидху et al. изменения подготовки электро компетентных клеток и ДНК от традиционных методов и значительно улучшенная библиотека разнообразия14.
В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Рисунок 1 показывает обзор строительства библиотеки, в том числе: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча dU-ssDNA; 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белок A/Л-на основе ELISA для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия. Штаммов, реагенты и оборудование, перечислены в таблице материала. Таблица 1 показывает установки реагента.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M H3PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC29570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM ATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18330-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM dithiothreitol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM dNTP mix</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-4065-60</td>
			<td>solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;,5,5&#8217;-tetramethylbenzidine (TMB)</td>
			<td>Kirkegaard &#38; Perry Laboratories Inc</td>
			<td>50-76-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, carb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1389</td>
			<td>100 mg/mL in water,&#160; 0.22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 100 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol, cmp</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>100 mg/mL in ethanol, 0.22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9620G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J637-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 peroxidase substrate</td>
			<td>Kirkegaard &#38; Perry Laboratories Inc</td>
			<td>50-65-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin, kan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC61129</td>
			<td>50 mg/mL in water,&#160; 0.22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 50 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>U19C015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS256</td>
			<td>! CAUTION NaOH causes burns.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NON-Fat Powdered Milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-HRP conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>101123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>22704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Protein L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>77679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0274S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline, tet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7660</td>
			<td>50 mg/mL in water, 0. 22 &#956;m filter-sterilize, work concentration: 10 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0123-07-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td>25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DF0127-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli CJ236</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E4141</td>
			<td>Genotype: dut-&#160; ung-&#160; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F&#39; camr). Used for preparation of dU-ssDNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli SS320</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60512</td>
			<td>Genotype: [F&#39;proAB+lacIq lacZ&#916;M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &#916;(araABC-leu)7679 &#916;lacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13KO7</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-cm gap electroporation cuvette</td>
			<td>BTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 2mL Deep-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>278743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Maxisorp immunoplates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>151759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baffled flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-630 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed shaker</td>
			<td>TAITEK</td>
			<td>MBR-034P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shaker</td>
			<td>QILINBEIER</td>
			<td>QB-9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handler for 96 and 384 wells</td>
			<td>RAININ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutil-channel pipette</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>E4XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon concentrator</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC803096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of synthetic phage displayed fab library with tailored diversity

Ежегодно растет спрос на моноклональных антител (mAbs) в фундаментальных исследований и медицины. Гибридомной технологии был доминирующим методом развития МАБ начиная со своего первого доклада в 1975 году. Как альтернативная технология ФАГ методы отображения для развития МАБ становятся все более привлекательными, поскольку Humira, первым антителом, фаг производные и один из бестселлеров mAbs, был одобрен для клинического лечения ревматоидного артрита в 2002 году. Как не животного на основе технологии развития МАБ, фаг дисплей обходит иммуногенность антигена, гуманизации и животных обслуживания, которые требуются от традиционных гибридомной технологии на основе антител развития. В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Этот протокол состоит из: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча урацил содержащих одноцепочечной ДНК (дю ssDNA); 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белка на основе A/Л энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия.

После схема строительство Fab библиотеки (см. рис. 1), мы подготовили помощник M13KO7 ФАГ предварительно зараженных кишечной палочки SS320 электро компетентных клеток. Эффективность этих электро компетентных клеток оценивается как 2 Х 109 cfu/мкг, когд?...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity at JoVE.com

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Этот протокол описывает подробную процедуру на строительство библиотеки отображается Фаговые синтетических антитела с учетом разнообразия. Синтетические антитела имеют широкое применение от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии.

Строительство синтетических Фаговые отображается ВСБ библиотеки с учетом разнообразия

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Биолюминесцентный &#39;Reporter Фаг для обнаружения Категория бактериальных патогенов

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Живая изображений Ячейка Сенная Bacillus И Пневмококк С использованием средства аварийного Покадровый микроскопии

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

После Cell-судьба<em&gt; E. палочки</em&gt; После заражения фагом лямбда

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Фаговые Phenomics: Физиологические подходы к характеризации Роман вирусных белков

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Перекрывающиеся пептид библиотека для сопоставления Qa-1 Epitopes в протеине

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Репликация Ordered, неизбыточной библиотека штамма PA14 Transposon вставки мутантов синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...