Name: microdissection of primary renal tissue segments and incorporation with novel scaffold-free construct technology
Uploaded: 2018-03-27T13:30:00
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NIH institutionnels de formation postdoctorale Grant, NIH-HL-007260

Toutes les interventions chirurgicales animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par les institutionnels et animalier utiliser Comité (IACUC) à la Medical University of South Carolina, avant toute chirurgie animale ou l’utilisation de n’importe quel tissus animaux.
1. murine néphrectomie
<ol><li>Don un masque chirurgical et bouffant cap afin de minimiser le risque de contamination. Maintenir la stérilité au cours de la mise en place de la zone chirurgicale.<ol>
<li>Placer des...

<ol>
	<li>Jha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+kidney+disease:+global+dimension+and+perspectives.">Chronic kidney disease: global dimension and perspectives.</a> Lancet. 382 (9888), 260-272 (2013).</li><li>2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. 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Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).</li><li>Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tissue+engineering.">Advances in tissue engineering.</a> Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).</li><li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells.">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).</li><li>Fisher, M. B., Mauck, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-Based+Therapeutics+and+Tissue+Engineering+Approaches+to+the+Amelioration+of+Chronic+Pancreatitis+and+Type+I+Diabetes:+Construction+and+Characterization+of+a+Novel+Prevascularized+Bioartificial+Pancreas.">Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas.</a> Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).</li><li>Al-Awqati, Q., Oliver, J. 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Méthodes utilisées pour vivre le tissu rénal constructions varient grandement en ce qui concerne le type de cellules et de biomatériaux utilisés et dans de nombreux cas, l’ingénieur sont obsolètes ou pas bien caractérisé dans la littérature7. Alors que beaucoup utilisent des approches de cellules souches ou récapitulant les différents composants de l’architecture rénale dans l’isolement, la perspective de recréer artificiellement un organe entier avec plus de 26 types de diffé...

Insuffisance rénale chronique (IRC) est l’un des défis majeurs de santé publique partout dans le monde actuel1. La prévalence de CKD aux États-Unis dépasse les 14 % de la population totale, avec plus 600 000 américains souffrant de la forme la plus sévère, stade terminal d’insuffisance rénale (terminale IRT)2. Les options de traitement actuelles disponibles pour les personnes souffrant d’insuffisance rénale terminale comprennent la transplantation de dialyse et des reins. Bien qu’environ 25.000 patients subissent chaque année de la transplantation rénale, un nombre important de patients est ajouté chaque année conduisant à une forte disparité entre les personnes en attente d’un organe de sauvetage et les récepteurs de transplantation3. En plus de ses graves effets négatifs sur la longévité et la qualité de vie, dialyse est associé à une charge financière étonnante. En 2014, l’assurance-maladie demandes payées ont totalisé $ 30 milliards pour les patients d’IRT2. Avec un approvisionnement limité orgue et aucune tendance à la baisse apparente chez les patients nécessitant une dialyse, les efforts de recherche visant à identifier des solutions alternatives à la dialyse et transplantation sont toujours importants. Même un délai relativement court dans la nécessité d’une dialyse augmente considérablement nombre du patient des années de vie ajustées pour la qualité et la productivité tout en reportant les coûts liés à la dialyse4,5,6.
Solutions pour la perte de tissu fonctionnel, comme celui de l’insuffisance rénale terminale, sont actuellement à l’étude en génie tissulaire et des laboratoires de médecine régénérative, avec des approches très variées allant de fabrication axée sur l’échafaud organoïde d’organes entiers à l’aide technique DECELLULARISE structures de l’orgue pour implantation cellulaire7,8,9,10,11. Récapitulant les structures rénales complexes des reins marginaux ou mis au rebut que partiellement a été étudiée. En fait, presque 20 % des reins achetés à la transplantation sont abandonnées pour diverses raisons12,13. Le tissu rénal fonctionnel de ces greffes présumés pourrait être utilisé et incorporé dans une ou plusieurs constructions tissulaire. Des études antérieures ont démontré la possibilité de travailler avec ces organes mis au rebut, utilisant les reins de la matrice extracellulaire pour tissus ingénierie fins14,15. Cependant, peu ont utilisé des principaux tissus nephronal des reins en bonne santé pour l’ingénierie tissulaire fins16,17,18.
Une méthode précédemment décrite par Kim et coll. implique isolement de « segments » rénales de reins des rats sains, qui ont été ensuite ensemencés sur des échafauds de (PGA) acides polyglycolique pour construction fabrication16. Cependant, peu d’information est donnée au sujet de la méthodologie exacte dissection et segments ont été obtenus d’une combinaison de hacher fines et de filtration. Nous décrivons une modification du présent protocole, qui produit de la même façon des segments rénales discrètes avec architecture nephronal intact, mais au contraire repose sur des techniques de microdissection. Suivie est effectuées sur des souris adultes vivants, après quoi les reins sont transférés dans le microscope de dissection où la capsule rénale est supprimée et le tissu est disséqué plus loin. Petit calibre 30½ G aiguilles sont utilisées comme instruments de coupe et également comme guide aidant à dissection, comme l’aiguille diamètre est égal au diamètre de la cible des segments rénales. Les segments isolés, en l’espèce murines, rénales maintiennent la viabilité en culture et intègrent avec des constructions cellulaires exempte d’échafaudage endothéliales-fibroblaste19. Ces constructions avaient déjà été utilisées à l’ingénieur d’autres organes, y compris un pancréas artificiel bio20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="706">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Non-fenestrated Sterile Field</td>
			<td style="width:181px;">Busse Hospital Disposables</td>
			<td style="width:153px;">696</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Fenestrated Sterile Field</td>
			<td style="width:181px;">Busse Hospital Disposables</td>
			<td style="width:153px;">697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Halsted Mosquito Forceps 5 Curved</td>
			<td style="width:181px;">Miltex</td>
			<td style="width:153px;">Mil-7-4</td>
			<td>&#34;Hemostat&#34; in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11155-10</td>
			<td>Fine forceps with teeth</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11152-10</td>
			<td>Fine forceps without teeth</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Fine Scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td style="width:181px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td>Iris Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%</td>
			<td style="width:181px;">Purdue Products L.P.</td>
			<td style="width:153px;">67618-151-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Sterile Cotton Gauze Pad (4&#34; x 4&#34;)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:153px;">22-415-469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Penicillin/Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:181px;">Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson</td>
			<td style="width:153px;">2254845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Nair Hair Remover</td>
			<td style="width:181px;">Nair</td>
			<td style="width:153px;">22600-23307</td>
			<td>Hair Removal Cream in text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:153px;">2705</td>
			<td>Diluted to 70% Ethanol Solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">BioLite 60mm Tissue Culture Dish</td>
			<td style="width:181px;">Themo-Scientific</td>
			<td style="width:153px;">130181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Press&#39;n Seal</td>
			<td style="width:181px;">Glad</td>
			<td style="width:153px;">12587-70441</td>
			<td>Applied to Stereoscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">SZX16 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:181px;">Olympus</td>
			<td style="width:153px;">SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Fiber Optic Illuminator</td>
			<td style="width:181px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:153px;">41720-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23&#34; L Gooseneck</td>
			<td style="width:181px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:153px;">EW-41720-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td style="width:181px;">Miltex</td>
			<td style="width:153px;">Mil-4-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15</td>
			<td style="width:181px;">Bard-Parker</td>
			<td style="width:153px;">371115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">31 1/2 Gauge Needle</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">14-826F</td>
			<td style="width:199px;">Becton Dickinson 305106</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:153px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Fetal Select 100% Bovine Serum</td>
			<td style="width:181px;">Atlas Biologicals</td>
			<td style="width:153px;">FS-0500-AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Normal Human Dermal Fibroblasts</td>
			<td style="width:181px;">Lonza</td>
			<td style="width:153px;">CC-2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Human Adipose Microvascular Endothelial Cells</td>
			<td style="width:181px;">Sciencell Research Laboratories</td>
			<td style="width:153px;">7200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Surgical Loupes (2.5x)</td>
			<td style="width:181px;">Orascoptic</td>
			<td style="width:153px;">(N/A) Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)</td>
			<td style="width:181px;">Lonza</td>
			<td style="width:153px;">CC-3131, CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)</td>
			<td style="width:181px;">Lonza</td>
			<td style="width:153px;">CC-3156, CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Anti-Cytokeratin-18 Antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A-21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:181px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A-11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Anti-Von Willebrand Factor Antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab6994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">A9771-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:181px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:153px;">561908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Background Buster</td>
			<td style="width:181px;">Innovex Biosciences</td>
			<td style="width:153px;">NB306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection of primary renal tissue segments and incorporation with novel scaffold-free construct technology

Transplantation rénale est maintenant une thérapie ordinaire pour insuffisance rénale terminale. Cependant, avec environ 96 000 personnes sur la liste d’attente et seulement un quart de ces patients atteignant la transplantation, il y a un besoin urgent d’alternatives pour ceux qui ont le défaut des organes. Afin de diminuer les conséquences néfastes de dialyse ainsi que les frais de soins de santé dans l’ensemble qu’elle engage, enquête active est en cours à la recherche de solutions alternatives aux greffes d’organes. Implantables tissulaire rénales constructions cellulaires sont une telle approche faisable pour remplacer la fonction rénale perdue. Décrite pour la première fois, voici la microdissection des reins murins pour l’isolement de vie corticomédullaire segments rénales. Ces segments sont capables d’intégration rapide au sein des constructions d’exempte d’échafaudage endothéliales-fibroblaste qui peut permettre une connexion rapide avec vascularisation hôte une fois implantée. Reins de souris adultes ont été achetés auprès de donneurs vivants, suivies par microdissection stéréoscope pour obtenir des segments rénales 200-300 µm de diamètre. Plusieurs constructions rénales ont été fabriquées en utilisant des segments rénales primaires ne récoltés qu’un seul rein. Cette méthode montre une procédure qui pourrait sauver le tissu rénal fonctionnel des organes qui pourrait autrement être mis au rebut.

Le protocole décrit produit environ 50 segments rénales par section3 pyramidale 2 mm de tissu rénal. Les segments rénales qui ont été traitées et imagés possèdent des composants tubulaires et glomérulaires dans des proportions différentes (voir Figure 2). Les segments intacts ont été soumis à un test afin de déterminer la viabilité des différents segments une fois toutes les 24 h pendant trois jours. Vert fluorescent calcéine-AM e...

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Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Tissulaire rénales constructions offrent une solution pour la pénurie d’organes et les effets délétères de la dialyse. Nous décrivons ici un protocole se rapportant au micro disséquer les reins murins pour l’isolement des segments cortico-médullaire. Ces segments sont implantés dans des constructions cellulaires exempte d’échafaudage, formant organoïdes rénale.

Microdissection de tissu rénal primaire Segments et intégration avec la technologie de nouvelle construction exempte d’échafaudage

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Méthodologie élastographie par résonance magnétique pour l&#39;évaluation des tissus Conçu croissance Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Recherche

Bio-ingénierie

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Une nouvelle plate-forme d&#39;étirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Épithéliale repeuplement cellulaire et préparation des rongeurs matrice extracellulaire échafaudages pour le développement de tissu rénal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting du Cartilage et peau tissus analogues utilisant un roman passif unité Technique de mélange pour Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

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Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

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Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...