Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes at JoVE.com

Vi takker Jessica Hall for hendes værdifulde diskussion.

1. forberedelse af primære insekt Spermatocyte cellekultur til Micromanipulation
<ol><li>Skub forberedelse<ol>
<li>Opnå en 75 mm x 25 mm glas dias med en 20 mm diameter cirkulære hul skåret ud i midten af diaset. Bemærk: Disse blev skåret fra et blad af vinduesglas til at være på størrelse med et glas dias med et hul i midten.</li>
		<li>Køre en 25 mm x 25 mm #1.5 coverslip gennem en bunsenbrænder flamme for 2 s.</li>
		<li>Anvende vakuum fedt rundt i kanten af hullet i glas dias</li>
		<li>Sted coverslip...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Med praksis, kan færdes kromosomer i cellen blive anden natur. Nåle, der er både tilstrækkeligt stive og tilstrækkelig tynd spids er svært at "få håndelag for" opdigte, men denne evne også kommer med praksis. Nåle, der er så fint at de deformeres når flyttede i halocarbon olie vil ikke være nyttigt for at skubbe kromosomer i cellen. Nåle, der er så afstumpede at deres tips er synlige og så store som 1/3 i bredden af et kromosom (eller større) er meget sandsynligt, at dræbe cellen. Oprettelsen af en nål...

Micromanipulation har afsløret dele af mekanismen for en kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevægelser. De tidligste publikation der beskriver resultaterne af micromanipulation eksperimenter blev af Robert Chambers1. Chambers anvendes en mekanisk micromanipulator med en vedhæftet glas nål for at sonde cytoplasmaet i en række forskellige celletyper. Desværre, kontrast metoder, der tillod visualisering af kromosomer og mange andre cellulære komponenter i levende celler var ikke tilgængelige på tidspunktet, så Chambers eksperimenter ikke kunne vise virkningerne af repositionering sådan cellulære komponenter. Tidlige micromanipulations, ændrede stillingen kromosom bruges apparatet kamre til at feje spindel midzone i anaphase celler, viser, at sådanne manipulationer kan ændre placeringen af kromosom arme i anaphase græshoppe neuroblasts2 . Nicklas og hans medarbejdere var først til at udføre fine micromanipulations af kromosomer, stretching kromosomer3, løsrive dem fra spindel og inducere en nyorientering3,4, stabilisere en malorientation ved at anvende spænding til kromosomer5,6,7, og måle de kræfter, der er produceret af spindler i anaphase8,9. Andet arbejde af Nicklas lab viste at cytoplasmatisk granulat kunne også være manipulerede10 og at centrosomes kunne flyttes af micromanipulation11. Micromanipulation er ikke kun nyttig til at flytte kromosomer og andre cellulære komponenter. En micromanipulation nål kan rent skære igennem en mitotiske spindel i demembranated celler12 eller kan bruges til at opløse de nukleare konvolut13. Derudover kan tilstødende celler være smeltet af micromanipulation14,15.
Med sådan en bred vifte af interessante eksperimenter, der kan gøres ved hjælp af micromanipulation, det er ved første øjekast overraskende, at micromanipulation eksperimenter har gjort meget få kromosom biologer. En af grundene til denne mangel er, at de mitotically dividere kulturperler celler, der er afledt af hvirveldyr væv og er almindeligt anvendt til at studere kromosom bevægelser er meget vanskelige at micromanipulate. Disse vævskultur celler har generelt en kortikale cytoskeleton, "kommer i vejen" af micromanipulation nål, og kromosomer enten ikke kan nås af nålen eller nålen kværner gennem celle, fører til en celle brud og død. Vi og andre eksperimentatorer, der bruger micromanipulation, har fundet leddyr celler til at være åbne over for micromanipulation. Leddyr spermatocytes spredes nemt under et lag af halocarbon olie og synes at have en langt mindre robust kortikale cytoskeleton underliggende cellemembranen under en celledeling. Således leddyr testiklerne giver en god kilde til meiotically dividere celler (spermatocytes) og mitotically dividere celler (spermatogonia) med let tilgængelige kromosomer for micromanipulation. En seriel skæring af en græshoppe spermatocyte fast under en manipulation afslørede at nålen aldrig trænger cellemembranen; cellemembranen deformerer omkring nålen (Nicklas R.B., personlig meddelelse). Spermatocytes fra en række insekt og spider taxa har været micromanipulated med succes, herunder græshopper, bedende mantids, bananfluer, kran fluer, græshopper, spittlebugs, møl, sort enke edderkopper, kælder edderkopper og orb-vævning edderkopper 3,7,17,18,19,20,21,22. Kulturperler, mitotically dividere celler fra insekter kan være micromanipulated. For eksempel, har kromosomer i grasshopper neuroblasts i en primær kultur kromosomer, der kan være let micromanipulated2,23. Vi formoder, at de tilgængelige kulturperler linjer stammer fra Drosophila og andre insekter bliver også micromanipulatable, selvom vi ikke har testet teknik med disse celler. Vi vil vise, hvordan dividere celler fra græshopper og fårekyllinger kan være forberedt på en micromanipulation. Fårekyllinger er let at opnå fra de fleste dyrehandlere til enhver tid af året. Græshopper er kun let kan indhentes i sommeren, medmindre forskeren har adgang til et laboratorium koloni, men de arter, der anvendes (Melanoplus sanguinipes) har let fladtrykt celler, og lange, let at manipulere kromosomer.
En anden grund hvorfor micromanipulation eksperimenter har været udført af en lille håndfuld biologer er at micromanipulators at flytte kromosomer godt er sjældent tilgængelige på markedet. Vi har fundet, at en joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulator styrer nålen bevægelse uden vibrationer, drift eller forsinkelse mellem bevægelsen joystick og nålen bevægelse, men andre typer af manipulatorer kan også med held skubbe kromosomer rundt i cellen. Micromanipulators designet af Ellis og Begg25,26 er ideel til micromanipulation af kromosomer, selvom de bruger ældre teknologi. Piezoelektriske micromanipulators er i øjeblikket tilgængelige og er almindeligt anvendt i Elektrofysiologi; disse micromanipulators er imidlertid ikke typisk joystick-kontrolleret. Joystick kontrol er nøglen til de glatte bevægelser kræves for en vellykket micromanipulation, og så en brugerdefineret joystick bør konstrueres til at gøre de aktuelt tilgængelige piezoelektriske micromanipulators arbejde for et kromosom micromanipulation. De joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulators, der fungerer bedst har direkte position kontrol, hvor bevægelse af joysticket kan oversættes direkte til en nål bevægelse.
En nyligt designet piezoelektriske micromanipulator kan konstrueres fra kommercielt tilgængelige dele, som kan udskiftes nemt og nogle små 3D-trykte komponenter, og det virker godt for kromosom micromanipulation24. Micromanipulator har justerbar følsomhed, manuel groft positionering, og ingen vibrationer, drift, eller forsinkelse i nålen bevægelse og direkte position kontrol af nålen. Forskere kan konstruere micromanipulator ved hjælp af instruktionerne tilgængelige online24. Nedenfor er metoderne til at forberede en primær spermatocyte cellekultur og for micromanipulating kromosomer i cellerne i denne kultur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

Micromanipulation af kromosomer har været en vigtig metode til belysning af mekanismen til kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevægelser, og har været nøglen til at forstå hvad styrer kromosom bevægelser under en celledeling. En dygtig biolog kan bruge en micromanipulator til at frigøre kromosomer fra spindel, flytte kromosomer i cellen og anvende styrker på kromosomer ved hjælp af et lille glas nål med en meget fin spids. Mens perturbationer kan stilles til kromosomer ved hjælp af andre metoder såsom optiske diffusering og andre anvendelser af en laser, til dato, tillader ingen anden metode Repositionering af cellulære komponenter på omfanget af snesevis til hundredvis af mikron med lidt at ingen skader på cellen .
Udvælgelse og forberedelse af passende celler til micromanipulation af kromosomer, der specifikt beskriver forberedelse af græshoppe og cricket spermatocyte primære kulturer til brug i live-celle imaging og micromanipulation, er beskrevet her. Derudover viser vi opførelsen af en nål til at bruges til at flytte kromosomer inden for cellen, og brug af en joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulator med en glas nål knyttet til det for at flytte kromosomer inden for delende celler. En prøve resultatet viser brugen af en micromanipulator at løsne et kromosom fra en spindel i en primær spermatocyte og flytte kromosomet inden for cellen.

Figur 6 viser en prøve micromanipulation af 2 tilstødende græshoppe primære spermatocytes i flere eksempler af de mulige anvendelser af micromanipulation. Dette forsøg blev gjort ved hjælp af en omvendt, fase-kontrast mikroskop. 0:00 (gange vist er i min:s) billede viser begge celler før manipulation. Et kromosom i cellen nederst er vist under spænding anvendes af micromanipulation nål (0:05; sort pil) og derefter helt løsrevet fra spindel (0:10; so...

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes at JoVE.com

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

I denne protokol beskrive vi udvælgelse og forberedelse af passende celler til micromanipulation og brugen af en piezoelektriske micromanipulator flytte kromosomer i disse celler.

Micromanipulation af kromosomer i insekt Spermatocytes

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i cellebiologi, såsom, hvor vigtigt er spænding i at opfylde spindel checkpoint, og hvad er den rolle på spindel vedhæftet fil i kromosom adfærd i miosis? Den største fordel ved denne teknik er, at det er en ikke-dødelige teknik, der gør det muligt for eksperimentatoren at anvende spænding på eller flytte kromosomer i en levende celle. Til at begynde, forberede en 75 af 25 millimeter dias med en 20 millimeter diameter cirkulært hul skåret ud af midten.Derefter køre en 25 med 25 millimeter nummer 1,5 dække slids gennem en bunsen brænder flamme i to sekunder. Påfør vakuumfedt omkring kanten af hullet i glasskredsen. Dernæst placere dækslet glide over hullet og tryk på den for at danne en stram forsegling.Vend glide over, og fyld den nyoprettede dissektion godt med halocarbon olie. Efter at have fået nogle voksne mandlige fårekyllinger, bruge dissekere saks til at skære gennem dorsale overflade parallelt med den lange akse i maven, direkte bag vingeknopper. Derefter forsigtigt klemme maven til at skubbe testiklerne gennem snittet i exoskelet.Brug saftafler, placere de isolerede testikler i dissektion godt. Under dissekerende mikroskop, bruge fine peger kraftbefæstelse til at opdele testiklerne i mindre stykker, og fjerne eventuelle fedt. Derefter sprede indholdet af testiklerne under olien på overfladen af dækslet slids.Fortsæt med at sprede indholdet af testiklerne, indtil spredningsdelen knap er synlig for det blotte øje. Yderligere oliebelastede dissektionsting, kan om nødvendigt anvendes. Først skal du placere enden af et glasrør i flammen af bunsen brænder.Hold enden af slangen for at skabe en 150 graders vinkel og et udvidet område af smalle glasrør. Bryd slangen i den tynde region, så den tynde region, der strækker sig fra den tidligere skabte vinkel, er ca. 10 millimeter lang. Ved hjælp af mikroforge, smelte spidsen af glasnålen, danner en 45 graders vinkel mellem nålen og platin wire af mikroforge.Træk derefter glasset væk fra ledningen, mens du samtidig slukker for varmen. Placer det tidligere forberedte dias på scenen af et omvendt fasekontrastmikroskop. Find derefter de opdelingsceller, og centrer dem i synsfeltet ved hjælp af den lavest mulige forstørrelse.Anbring mikronålen i mikromanipulatorens nåleholder. Placer derefter mikronålen manuelt i mikroskopets lysbane. Fokuser mikroskopet flere fokale planer over det plan, der indeholder cellerne.Brug derefter joystickcontrolleren til at flytte mikronålen flere gange for at finde skyggen af nålen i x- og y-akserne. Juster nålens position, indtil spidsens placering er synlig, og juster derefter nålens position langs z-aksen, indtil spidsen er i fokus. Dernæst refokuser på cellerne, og fokuser mikroskopet lige over celleplanet.Derefter justere placeringen af nålen, så spidsen er i fokus i dette brændpunkt plan. Gentag denne proces ved hjælp af den højere forstørrelsesmålsætning og en højere følsomhedsindstilling. Refocus på cellerne, og justere deres position, så de forbliver i midten af synsfeltet.Brug joysticket til at styre mikronålen, da det skubber kromosomer rundt inde i cellen. Sørg for, at nålespidsen forbliver i flyet over cellerne. Hvis du vil flytte kromosomet, skal du fokusere på et kromosom nær toppen af cellen.Juster derefter z-aksen på joysticket for at bringe nålespidsen i fokus, og flyt nålen med joysticket i x og y. Placer spidsen af nålen direkte på det kromosom af interesse, og skub den i den ønskede retning. Påfør nok spænding til at adskille kromosomet fra spindelen.Endelig skal du placere kromosomet hvor som helst i cellen. Ved hjælp af denne protokol, er det muligt at flytte, anvende spændinger på, og helt frigøre et kromosom fra en spindel ved hjælp af micromanipulation. I dette eksempel blev to manipulerede kromosomer holdt fra at fastgøre til spindelen igen ved hele tiden at blive skubbet med en mikromanipulationsnål.Når der er styr på prøverne, kan prøverne forberedes til manipulation, og mikromanipulatoren kan placeres på 15 til 20 minutter. Micromanipulation eksperimenter kan tage alt fra et par sekunder til flere timer. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at manipulere kromosomer på siden af cellen længst fra dækslet slip.Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for cellebiologi at udforske spindel checkpoint i græshopper og bedende mantis.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolleret kortikal indvirkning model af mus hjerneskade med terapeutisk transplantation af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte neurale celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...