Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes at JoVE.com

Wij danken Jessica Hall voor haar waardevolle discussie.

1. bereiding van de cultuur van de cel van de primaire Insect Spermatocyte Micromanipulation
<ol><li>Prepareren van objectglaasjes<ol>
<li>Het verkrijgen van een glasplaatje 75 x 25 mm met een 20 mm diameter ronde gat in het midden van de dia uitgesneden. Opmerking: Deze werden gesneden uit een vel van vensterglas tot de grootte van een glasplaatje met een gat in het midden.</li>
		<li>Een 25 mm x 25 mm #1.5 dekglaasje aan doorlopen een vlam Bunsenbrander voor 2 s.</li>
		<li>Vacuüm vet rond de rand van het gat in ...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Met praktijk kan chromosomen bewegen in de cel tweede natuur geworden. Naalden die zowel voldoende stijf en voldoende dun-tipped zijn moeilijk om "de handigheid van" fabriceren, maar dit vermogen komt ook met de praktijk. Naalden die zo fijn dat ze vervormen wanneer verplaatst in de halonen-olie zijn bruikbaar niet voor het duwen van de chromosomen in de cel. Naalden die zo bot dat hun tips zichtbaar zijn en zo groot als 1/3 van de breedte van een chromosoom (of groter) zeer waarschijnlijk zijn te doden van de cel. De op...

Micromanipulation is gebleken dat delen van het mechanisme voor een chromosoom congression, de spindel checkpoint en anafase chromosoom bewegingen. De vroegste publicatie met een beschrijving van de resultaten van de experimenten van de micromanipulation werd door Robert Chambers1. Chambers gebruikt een mechanische micromanipulator met een bijgevoegde glas naald sonde het cytoplasma van een aantal verschillende soorten cellen. Helaas, contrast methoden waardoor de visualisatie van chromosomen en vele andere cellulaire componenten in levende cellen niet beschikbaar waren op het moment, dus Chambers experimenten niet laten van de gevolgen zien kon van dergelijke cellulaire componenten herpositionering. Vroege micromanipulations die de positie van het chromosoom veranderd gebruikt het apparaat Chambers te vegen van de midzone van de spindel in anafase cellen, waaruit blijkt dat dergelijke manipulaties als u de positie van chromosoom wapens in anafase sprinkhaan neuroblasten2 veranderen kunnen . Nicklas en zijn medewerkers waren de eersten die het uitvoeren van fijne micromanipulations van chromosomen, rekken van de chromosomen3, hen loskoppelen van de spindel en inducerende een heroriëntatie3,4, stabiliseren van een malorientation door de spanning op de chromosomen5,6,7toe te passen en het meten van de krachten die geproduceerd door spindels in anafase8,9. Ander werk door de Nicklas lab toonde dat cytoplasmatische korrels gemanipuleerde10 ook zou kunnen zijn en dat centrosomes kan worden verplaatst door micromanipulation11. Micromanipulation is niet alleen nuttig voor het verplaatsen van de chromosomen en de andere cellulaire componenten. Een naald micromanipulation netjes kan snijden door middel van een mitotische spindel in demembranated cellen12 of kan worden gebruikt voor het ontbinden van de nucleaire envelop13. Daarnaast kunnen aangrenzende cellen worden gesmolten door micromanipulation14,15.
Met dergelijke een breed scala aan interessante experimenten die kunnen worden gedaan met behulp van micromanipulation, het is op het eerste gezicht verrassend dat micromanipulation experimenten zijn gedaan door zeer weinig chromosoom biologen. Een van de redenen voor deze tekortkoming is dat de mitotically-delende gekweekte cellen die zijn afgeleid van gewervelde weefsels en worden vaak gebruikt voor het bestuderen van chromosoom bewegingen uiterst moeilijk te micromanipulate. Deze weefselkweek cellen hebben over het algemeen een corticale cytoskelet dat "krijgt in de manier" van de micromanipulation naald, en chromosomen of kunnen niet worden bereikt door de naald of de naald via de cel maalt, wat leidt tot een breuk van de cel en de dood. Wij, en andere onderzoekers die gebruik maken van micromanipulation, hebben gevonden geleedpotigen cellen worden vatbaar voor micromanipulation. Geleedpotigen spermatocyten worden gemakkelijk verspreid onder een laag van halonen olie en lijken te hebben een veel minder robuuste corticale cytoskelet ten grondslag liggen aan de celmembraan tijdens een celdeling. Dus, geleedpotigen teelballen bieden een goede bron van meiotically-delende cellen (spermatocyten) en mitotically-delende cellen (testis) met gemakkelijk toegankelijke chromosomen voor micromanipulation. Een seriële segmenteren van een sprinkhaan-spermatocyte vaste tijdens een manipulatie geopenbaard dat de naald nooit de celmembraan doordringt; de celmembraan vervormt rond de naald (Nicklas R.B., persoonlijke mededeling). Spermatocyten uit een aantal insecten en spinnen taxa geweest micromanipulated met succes, met inbegrip van sprinkhanen, biddende mantids fruitvliegjes, crane vliegen, krekels, spittlebugs, motten, zwarte weduwe spinnen, kelder spinnen en orb-weven spinnen 3,7,17,18,19,20,21,22. Gekweekte, mitotically-delende cellen van insecten kunnen micromanipulated. Bijvoorbeeld, hebben de chromosomen in de sprinkhaan neuroblasten in een primaire cultuur chromosomen die gemakkelijk micromanipulated2,23 kunnen. We vermoeden dat de beschikbare lijnen afgeleid van Drosophila gekweekte en andere insecten ook micromanipulatable zullen, maar we niet de techniek met deze cellen getest hebben. Zullen we laten zien hoe delen van cellen van sprinkhanen en krekels kan worden voorbereid voor een micromanipulation. Krekels zijn eenvoudig te verkrijgen van de meeste dierenwinkels op elk moment van het jaar. Sprinkhanen zijn alleen gemakkelijk verkrijgbaar is in de zomer, tenzij de onderzoeker toegang tot een laboratorium kolonie heeft, maar de soorten gebruikt (Melanoplus sanguinipes) gemakkelijk cellen en lang, gemakkelijk-aan-manipuleren chromosomen afgevlakt is.
Een andere reden waarom micromanipulation experimenten zijn gedaan door een klein handvol biologen is dat micromanipulators die goed bewegen van chromosomen zelden beschikbaar in de markt zijn. We hebben ontdekt dat een joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulator de beweging van de naald met geen trillingen, drift, of lag tussen de joystick en de beweging van de naald bestuurt, maar andere soorten manipulatoren ook met succes chromosomen duwen kunnen rond in de cel. De micromanipulators ontworpen door Ellis en Begg25,26 zijn ideaal voor de micromanipulation van de chromosomen, hoewel ze gebruik van oudere technologie. Piëzo-elektrische micromanipulators zijn momenteel beschikbaar en gebruikte in de elektrofysiologie; Deze micromanipulators zijn echter niet typisch joystick-gecontroleerde. Joystick-controle is de sleutel tot de vloeiende bewegingen die nodig zijn voor een succesvolle micromanipulation, en zo een aangepaste joystick te maken van de momenteel beschikbare piëzo-elektrische micromanipulators werken voor een chromosoom micromanipulation moet worden gebouwd. De joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulators die het beste werken hebben directe positie controle, waarin de beweging van de joystick rechtstreeks naar een beweging van de naald vertaalt.
Een nieuw ontworpen piëzo-elektrische micromanipulator figuur kan worden geconstrueerd van verkrijgbare onderdelen die gemakkelijk kunnen worden vervangen en van sommige kleine 3D-gedrukte onderdelen, en het werkt goed voor chromosoom micromanipulation24. De micromanipulator heeft instelbare gevoeligheid, handmatige grof positionering, en geen trillingen, drift, of lag in de beweging van de naald, en de controle van de directe positie van de naald. Wetenschappers kunnen construeren de micromanipulator met behulp van instructies beschikbaar online24. Hieronder vindt u de methoden voor het voorbereiden van de cultuur van de cel van een primaire spermatocyte en micromanipulating de chromosomen in de cellen in die cultuur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

De micromanipulation van de chromosomen is een essentiële methode voor de verlichting van het mechanisme voor chromosoom congression, de spindel checkpoint en anafase chromosoom bewegingen, en is de sleutel tot het begrijpen wat regelt chromosoom bewegingen tijdens een celdeling. Een geschoolde bioloog kunt een micromanipulator loskoppelen van de chromosomen van de spindel, chromosomen verplaatsen binnen de cel, en krachten om op te passen met behulp van een kleine glazen naald met een zeer fijne tip chromosomen. Terwijl verstoringen kunnen worden gemaakt aan chromosomen met behulp van andere methoden zoals optische overlapping en ander gebruik van een laser, tot op heden geen andere methode maakt het mogelijk de herpositionering van cellulaire componenten op de schaal van tientallen tot honderden micron met weinig tot geen schade aan de cel .
De selectie en de voorbereiding van geschikte cellen voor de micromanipulation van de chromosomen, specifiek met een beschrijving van de voorbereiding van de sprinkhaan en cricket spermatocyte primaire culturen voor het gebruik in live-cel beeldvorming en micromanipulation, zijn hier beschreven. Bovendien tonen we de bouw van een naald worden gebruikt voor het verplaatsen van de chromosomen in de cel, en het gebruik van een joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulator met een glas naald eraan verbonden zijn om te verplaatsen van chromosomen binnen scheidslijn cellen. Een steekproef-resultaat toont het gebruik van een micromanipulator om een chromosoom van een spindel in een primaire spermatocyte los te maken en dat chromosoom verplaatsen binnen de cel.

Figuur 6 toont een micromanipulation monster van 2 aangrenzende sprinkhaan primaire spermatocyten in diverse voorbeelden van de mogelijke toepassingen van de micromanipulation. Dit experiment werd gedaan met behulp van een omgekeerde, fase contrast Microscoop. De 0:00 (tijden weergegeven zijn in min:s) afbeelding toont beide cellen vóór de manipulatie. Één chromosoom in de onderste cel wordt weergegeven onder spanning toegepast door de micromanipulation-n...

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes at JoVE.com

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

In dit protocol beschrijven we de selectie en de voorbereiding van geschikte cellen voor micromanipulation en het gebruik van een piëzo-elektrische micromanipulator chromosomen verplaatsen binnen die cellen.

Micromanipulation van chromosomen in Insect spermatocyten

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals, hoe belangrijk is spanning bij het voldoen aan de as checkpoint, en wat is de rol op spindel gehechtheid in chromosoom gedrag in miose? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een niet-dodelijke techniek is die de onderzoeker in staat stelt om spanning toe te passen op, of te herpositioneren chromosomen in een levende cel. Om te beginnen, bereid een 75 bij 25 millimeter dia met een 20 millimeter diameter cirkelvormige gat uitgesneden uit het centrum.Dan, voer een 25 bij 25 millimeter nummer 1,5 cover spleet door een bunsen brander vlam voor twee seconden. Breng vacuümvet aan rond de rand van het gat in de glazen schuif. Plaats vervolgens de cover slip over het gat en druk erop om een strakke afdichting te vormen.Draai de schuif om en vul de nieuw gecreëerde dissectie goed met halocarbon olie. Na het verkrijgen van een aantal volwassen mannelijke krekels, gebruik ontleden schaar te snijden door de rug oppervlak parallel aan de lange as van de buik, direct achter de vleugel knoppen. Knijp vervolgens voorzichtig in de buik om de teelballen door de snede in het exoskelet te duwen.Met behulp van tangen, plaats de geïsoleerde teelballen in de dissectie goed. Gebruik onder de ontledenmicroscoop fijne wijzende tangen om de teelballen in kleinere stukken te verdelen en vet te verwijderen. Vervolgens, verspreid de inhoud van de teelballen onder de olie op het oppervlak van de cover spleet.Blijf de inhoud van de teelballen verspreiden totdat het verspreidingsgedeelte nauwelijks zichtbaar is voor het blote oog. Indien nodig kunnen extra oliegelaste dissectieputten worden gebruikt. Plaats eerst het uiteinde van een glazen buis in de vlam van bunsen brander.Houd het einde van de slang om een hoek van 150 graden en een uitgebreid gebied van smalle glazen buizen te creëren. Breek de slang in het dunne gebied, zodat het dunne gebied dat zich uitstrekt van de eerder gecreëerde hoek ongeveer 10 millimeter lang is. Met behulp van de microforge, smelt de punt van de glasnaald, de vorming van een hoek van 45 graden tussen de naald en de platina draad van de microforge.Trek vervolgens het glas uit de buurt van de draad terwijl u tegelijkertijd het vuur uitschakelt. Plaats de eerder voorbereide dia op het podium van een omgekeerde fase contrastmicroscoop. Zoek vervolgens de delende cellen en centreer ze in het gezichtsveld met behulp van de laagst mogelijke vergroting.Plaats de microneedle in de naaldhouder van de micromanipulator. Plaats vervolgens handmatig de microneedle in het lichtpad van de microscoop. Focus de microscoop verschillende brandpuntsvlakken boven het vlak met de cellen.Gebruik vervolgens de joystickcontroller om de microneedle meerdere keren te verplaatsen om de schaduw van de naald in de x- en y-assen te vinden. Pas de naaldpositie aan totdat de positie van de punt zichtbaar is en pas vervolgens de positie van de naald langs de z-as aan totdat de punt scherp is. Vervolgens, opnieuw richten op de cellen, en focus de microscoop net boven de cel vlak.Vervolgens u de positie van de naald aanpassen, zodat de punt scherp is in dit brandpuntsvlak. Herhaal dit proces met behulp van de hogere vergrotingsdoelstelling en een hogere gevoeligheidsinstelling. Richt u opnieuw op de cellen en pas hun positie aan, zodat ze in het midden van het gezichtsveld blijven.Gebruik de joystick om de microneedle te controleren als het chromosomen duwt rond in de cel. Zorg ervoor dat de naaldpunt in het vlak boven de cellen blijft. Om het chromosoom te verplaatsen, focus op een chromosoom in de buurt van de bovenkant van de cel.Stel vervolgens de z-as op de joystick aan om de naaldpunt in beeld te brengen en beweeg de naald met de joystick in x en y. Plaats de punt van de naald direct op het chromosoom van belang, en duw het in de gewenste richting. Breng voldoende spanning aan om het chromosoom van de as te scheiden.Tot slot, plaats het chromosoom overal in de cel. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om spanning te herpositioneren, toe te passen en een chromosoom volledig los te maken van een as met behulp van micromanipulatie. In dit voorbeeld werden twee gemanipuleerde chromosomen gehouden van het opnieuw bevestigen aan de as door voortdurend te worden nudged met een micromanipulatie naald.Eenmaal onder de knie, monsters kunnen worden voorbereid op manipulatie, en de micromanipulator kan worden geplaatst in 15 tot 20 minuten. Micromanipulatie-experimenten kunnen enkele seconden tot enkele uren duren. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om chromosomen te manipuleren aan de zijkant van de cel het verst van de cover slip.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van celbiologie om het spindelcontrolepunt in sprinkhanen en bidsprinkhaan te verkennen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...