Name: micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00
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Nous remercions Jessica Hall pour son précieux travail.

1. préparation de la Culture de cellules primaires Spermatocyte insectes Micromanipulation
<ol><li>Préparation des lames<ol>
<li>Obtenir une lame de verre de 75 mm x 25 mm avec un trou circulaire de 20 mm de diamètre, découper au centre de la diapositive. NOTE : Elles ont été coupées d’une seule feuille de verre à vitre à la taille d’une lame de verre avec un trou au centre.</li>
		<li>Une lamelle de 25 x 25 mm #1.5 faire executer une flamme de bec Bunsen pour 2 s.</li>
		<li>Appliquez de la graisse so...

<ol>
	<li>Chambers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+II.+The+cell+aster:+a+reversible+gelation+phenomenon.">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li><li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper,+Chortophaga+viridifasciata.">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li><li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle.">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis.">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes.">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li><li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+error+correction+in+mitosis:+microtubule+capture,+release,+and+tension.">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li><li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint.">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase.">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis.">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li><li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis.">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells.">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li><li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+cut+mitotic+spindles:+clean+cuts+and+stable+microtubules.">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes.">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li><li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+distribution:+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro.">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes.">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li><li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulated+bivalents+can+trigger+mini-spindle+formation+in+Drosophilamelanogaster+spermatocyte+cytoplasm.">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li><li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes.">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li><li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis.">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li><li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+(Araneae,+Theridiidae).">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li><li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius.">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li><li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype,+sex+determination,+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+(Araneomorphae,+Pholcidae)+spiders:+implications+for+karyotype+evolution.">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748 (2011).</li><li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+(Walckenaer).">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li><li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension.">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).</li><li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+micromanipulators.">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li><li>Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+micromanipulation+studies.">Chromosome micromanipulation studies.</a> Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope.">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li><li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes.">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li><li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase'+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes.">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li></ol>

Avec la pratique, de déplacer des chromosomes dans la cellule peut devenir une seconde nature. Les aiguilles qui sont suffisamment rigides et suffisamment mince pointe sont difficiles à « obtenir le don de » fabriquer, mais cette capacité est également livré avec la pratique. Les aiguilles qui sont si fines qu’elles déforment quand ils sont déplacés dans le Huilehalocarbone ne sera pas utiles pour pousser les chromosomes de la cellule. Les aiguilles qui sont tellement brutal que leurs conseils sont visibles...

Micromanipulation a révélé des pièces du mécanisme pour une chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase. La première publication décrivant les résultats des expériences de micromanipulation était par Robert Chambers1. Chambers a utilisé un micromanipulateur mécanique avec une aiguille de verre ci-joint pour sonder le cytoplasme d’un certain nombre de différents types cellulaires. Malheureusement, les méthodes de contraste permettant la visualisation des chromosomes et de nombreux autres composants cellulaires dans les cellules vivantes n’étaient pas disponibles dans le temps, donc expériences Chambers' impossible d’afficher les effets de ces composants cellulaires de repositionnement. Micromanipulations précoces qui a modifié la position chromosomique utilisé l’appareil Chambers à balayer le milieu de la broche dans les cellules de l’anaphase, montrant que ces manipulations pourraient modifier la position des bras chromosomiques en neuroblastes sauterelle de l’anaphase2 . Nicklas et ses collaborateurs furent les premiers à effectuer des micromanipulations fines des chromosomes, qui s’étend des chromosomes3, détacher de la fusée et induisant une réorientation3,4, stabiliser une malorientation en appliquant la tension pour les chromosomes5,6,7et en mesurant les forces produites par pivots en anaphase8,9. Autre travaux par le laboratoire de Nicklas ont montré que les granules cytoplasmiques pourraient également être manipulé10 et que les centrosomes pourraient être réorientées en micromanipulation11. Micromanipulation n’est pas seulement utile pour déplacer des chromosomes et autres composants cellulaires. Une aiguille de micromanipulation peut couper proprement un fuseau mitotique dans demembranated cellules12 ou peut être utilisée pour dissoudre l' enveloppe nucléaire13. En outre, les cellules adjacentes peuvent être fusionnés par micromanipulation14,15.
Avec une telle variété d’expériences intéressantes qui peut être fait à l’aide de micromanipulation, c’est à première vue surprenant que micromanipulation expériences ont été faites par très peu de biologistes du chromosome. Une des raisons de cette carence, c’est que les cellules cultivées de division mitotique qui sont dérivées de tissus vertébrés et sont couramment utilisés pour l’étude des mouvements des chromosomes sont extrêmement difficiles à micromanipulate. Ces cellules de culture de tissu ont généralement un cytosquelette cortical que « obtient de la manière » de la micromanipulation aiguille et chromosomes non plus n’est pas joignable par l’aiguille ou Marc de l’aiguille à travers la cellule, conduisant à une rupture de cellules et de la mort. Autres expérimentateurs qui utilisent la micromanipulation, et nous avons trouvé arthropodes cellules à se prêter à la micromanipulation. Les spermatocytes arthropodes sont facilement se propager sous une couche de Huilehalocarbone et semblent avoir un cytosquelette cortical beaucoup moins robuste qui sous-tendent la membrane cellulaire au cours d’une division cellulaire. Ainsi, les testicules arthropodes constituent une bonne source de cellules de division de méiose (spermatocytes) et de division mitotique des cellules (spermatogonies) avec des chromosomes facilement accessibles pour la micromanipulation. Une série de sectionnement d’un spermatocyte sauterelle fixé pendant une manipulation a révélé que l’aiguille pénètre jamais dans la membrane cellulaire ; la membrane cellulaire se déforme autour de l’aiguille (Nicklas R.B., communication personnelle). Les spermatocytes de plusieurs taxons d’insectes et araignées ont été micromanipulés avec succès, y compris les sauterelles, les Mantes priant, drosophiles, tipules, grillons, cercopes, papillons, araignées veuve noire, cave araignées et orb-weaving spiders 3,7,17,18,19,20,21,22. Des cellules cultivées, facteur de division mitotique des insectes peuvent être micromanipulés. Par exemple, les chromosomes en neuroblastes sauterelle dans une culture primaire ont des chromosomes qui peuvent être facilement micromanipulés2,23. Nous soupçonnons que la disposition cultivés lignées dérivées de drosophile et autres insectes seront également micromanipulatable, bien que nous n’avons pas testé la technique avec ces cellules. Nous allons montrer comment diviser des cellules de sauterelles et les grillons peut être préparé pour une micromanipulation. Grillons sont faciles à obtenir de la plupart des magasins pour animaux de compagnie à tout moment de l’année. Les sauterelles ne sont faciles à obtenir en été à moins que le chercheur a accès à une colonie de laboratoire, mais l’espèce utilisée (Melanoplus sanguinipes) a aplani facilement les cellules et longs, facile-à-manipuler les chromosomes.
Une autre raison pourquoi les expériences de micromanipulation ont été faites par une petite poignée de biologistes est que micromanipulateurs qui bougent bien les chromosomes sont rarement disponibles sur le marché. Nous avons constaté qu’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par manette contrôle le mouvement de l’aiguille sans vibration, dérive, ou le décalage entre les mouvements de la manette et le déplacement de l’aiguille, mais les autres types de manipulateurs peuvent pousser aussi avec succès des chromosomes autour de la cellule. Les micromanipulateurs conçus par Ellis et Begg25,26 sont idéales pour la micromanipulation des chromosomes, bien qu’elles utilisent la technologie plus ancienne. Micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE sont actuellement disponibles et couramment utilisés en électrophysiologie ; Toutefois, ces micromanipulateurs ne sont pas généralement contrôlée par joystick. Contrôle de manette de jeu est essentielle pour le mouvement lisse d’une micromanipulation réussie, et donc une manette de jeu personnalisé doit être construite pour faire les micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE actuellement disponibles fonctionnent pour une micromanipulation de chromosome. Les micromanipulateurs piézoélectriques contrôlées par joystick qui fonctionnent le mieux ont contrôle de position directe, où le mouvement du levier de commande se traduit directement à un déplacement de l’aiguille.
Un micromanipulateur piézoélectrique nouvellement conçu peut être construit de pièces disponibles sur le marché qui peuvent être facilement remplacés et de quelques petits composants imprimés 3D, et il fonctionne bien pour le chromosome micromanipulation24. Le micromanipulateur n’a sensibilité réglable, positionnement manuel grossier et aucune vibration, dérive ou retard dans le mouvement de l’aiguille et le contrôle direct de position de l’aiguille. Les scientifiques peuvent construire le micromanipulateur à l’aide d’instructions disponibles en ligne24. Voici les méthodes de préparation d’une culture de cellules de spermatocytes primaires et pour micromanipulating les chromosomes dans les cellules de cette culture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VWR micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366 249</td>
			<td style="width:167px;">25x25 mm, no 1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dow Corning High Vacuum Grease</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>AA44224-KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">KEL-F Oil #10</td>
			<td style="width:71px;">Ohio Valley Specialty Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3271-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dumont #5 fine foreceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Custom order--call to request</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective</td>
			<td style="width:71px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">microforge</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Narashige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">micromanipulator</td>
			<td style="width:71px;">either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick</td>
			<td style="width:119px;">PCS-6300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation of chromosomes in insect spermatocytes

La micromanipulation des chromosomes est une méthode essentielle pour éclairer le mécanisme de chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase et a joué un rôle clé pour comprendre ce qui contrôle les mouvements du chromosome au cours d’une division cellulaire. Un biologiste qualifié peut utiliser un micromanipulateur pour détacher les chromosomes de la broche, de repositionner des chromosomes dans les cellules et d’appliquer des forces aux chromosomes à l’aide d’une aiguille de petit verre avec une pointe très fine. Tandis que des perturbations sont possibles aux chromosomes à l’aide d’autres méthodes comme le piégeage optique et autres utilisations d’un laser, à ce jour, aucune autre méthode ne permet le repositionnement des composants cellulaires à l’échelle de quelques dizaines à plusieurs centaines de microns avec peu ou pas de dommages à la cellule .
La sélection et la préparation des cellules appropriées pour la micromanipulation des chromosomes, décrivant spécifiquement la préparation des cultures primaires de sauterelle et le cricket spermatocyte pour l’imagerie de cellules vivantes et micromanipulation, sont décrit ici. En outre, nous montrons la construction d’une aiguille à utiliser pour le déplacement des chromosomes au sein de la cellule et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par joystick avec une aiguille de verre attachée à elle pour repositionner des chromosomes dans les cellules en division. Un résultat de l’échantillon montre l’utilisation d’un micromanipulateur pour détacher un chromosome d’un axe dans un spermatocyte primaire et de repositionner ce chromosome au sein de la cellule.

La figure 6 montre une micromanipulation échantillon de 2 spermatocytes primaires adjacentes sauterelle dans plusieurs exemples des utilisations possibles de micromanipulation. Cette expérience a été faite à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée,. 0:00 (les heures indiquées sont en min:s) image montre les deux cellules avant la manipulation. Un chromosome dans la cellule inférieure apparaît plus sous tension appliquée par l’aig...

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Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

Dans ce protocole, nous décrivons la sélection et la préparation de cellules appropriées pour micromanipulation et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique à repositionner des chromosomes dans les cellules.

Micromanipulation des Chromosomes dans les Spermatocytes insectes

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que, quelle est l’importance de la tension dans la satisfaction du point de contrôle fuseau, et quel est le rôle sur l’attachement fuseau dans le comportement chromosomique dans la miose? Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique non létale qui permet à l’expérimentateur d’appliquer une tension ou de repositionner des chromosomes dans une cellule vivante. Pour commencer, préparez une glissière de 75 x 25 millimètres avec un trou circulaire de 20 millimètres de diamètre découpé au centre.Ensuite, exécutez une fente de couverture de 25 par 25 millimètres 1,5 à travers une flamme de brûleur bunsen pendant deux secondes. Appliquer la graisse sous vide autour du bord du trou dans la glissière en verre. Ensuite, placez le couvercle glisser sur le trou et appuyez dessus pour former un joint serré.Retournez la glissade et remplissez bien la dissection nouvellement créée d’huile d’halocarbone. Après avoir obtenu des grillons mâles adultes, utilisez des ciseaux disséquants pour couper à travers la surface dorsale parallèle au long axe de l’abdomen, directement derrière les bourgeons de l’aile. Puis, serrez doucement l’abdomen pour pousser les testicules à travers la coupe dans l’exosquelette.À l’aide de forceps, placer les testicules isolés dans le puits de dissection. Sous le microscope disséquant, utiliser des forceps de pointage fins pour diviser les testicules en petits morceaux, et enlever toute graisse. Ensuite, étalez le contenu des testicules sous l’huile à la surface de la fente du couvercle.Continuer à répandre le contenu des testicules jusqu’à ce que la partie de propagation soit à peine visible à l’œil nu. D’autres puits de dissection chargés d’huile peuvent être utilisés si nécessaire. Tout d’abord, placez l’extrémité d’un tube de verre dans la flamme du brûleur bunsen.Tenez l’extrémité du tube pour créer un angle de 150 degrés et une zone étendue de tubes en verre étroits. Casser le tube dans la région mince de sorte que la région mince s’étendant de l’angle précédemment créé est d’environ 10 millimètres de long. À l’aide de la microforge, faire fondre la pointe de l’aiguille en verre, formant un angle de 45 degrés entre l’aiguille et le fil de platine de la microforge.Ensuite, retirez le verre du fil tout en éteignez simultanément le feu. Placez la diapositive préparée précédemment sur la scène d’un microscope à contraste de phase inversé. Ensuite, trouvez les cellules de division et centrez-les dans le champ de vision en utilisant le grossissement le plus bas possible.Placez le microneedle dans le porte-aiguille du micromanipulateur. Ensuite, placez manuellement le microneedle dans la trajectoire lumineuse du microscope. Concentrez le microscope plusieurs plans focaux au-dessus du plan contenant les cellules.Ensuite, utilisez le contrôleur joystick pour repositionner le microneedle plusieurs fois pour trouver l’ombre de l’aiguille dans les axes x et y. Réajustez la position de l’aiguille jusqu’à ce que la position de la pointe soit visible, puis ajustez la position de l’aiguille le long de l’axe z jusqu’à ce que la pointe soit au point. Ensuite, recentrer sur les cellules, et concentrer le microscope juste au-dessus du plan cellulaire.Ensuite, réajustez la position de l’aiguille de sorte que la pointe est au point dans ce plan focal. Répétez ce processus à l’aide de l’objectif de grossissement plus élevé et d’un réglage de sensibilité plus élevé. Recentrer sur les cellules, et ajuster leur position, de sorte qu’ils restent au centre du champ de vision.Utilisez le joystick pour contrôler le microneedle car il pousse les chromosomes autour de l’intérieur de la cellule. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille reste dans le plan au-dessus des cellules. Pour déplacer le chromosome, concentrez-vous sur un chromosome près du haut de la cellule.Ensuite, ajustez l’axe z sur le joystick pour mettre la pointe de l’aiguille au point, et déplacez l’aiguille avec le joystick en x et y. Placez le bout de l’aiguille directement sur le chromosome d’intérêt, et poussez-le dans la direction désirée. Appliquez suffisamment de tension pour séparer le chromosome du fuseau.Enfin, placez le chromosome n’importe où dans la cellule. En utilisant ce protocole, il est possible de repositionner, d’appliquer une tension et de détacher complètement un chromosome d’un fuseau à l’aide de micromanipulation. Dans cet exemple, deux chromosomes manipulés ont été empêchés de se rattacher au fuseau en étant continuellement poussés avec une aiguille de micromanipulation.Une fois maîtrisés, les échantillons peuvent être préparés pour manipulation, et le micromanipulateur peut être positionné en 15 à 20 minutes. Les expériences de micromanipulation peuvent prendre de quelques secondes à plusieurs heures. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les chromosomes sur le côté de la cellule le plus éloigné de la feuille de couverture.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer le point de contrôle des broches dans les sauterelles et la mante religieuse.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Recherche

Biologie du développement

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The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

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